تجزیه و تحلیل DNA

تجزیه و تحلیل  DNAرامی توان در بسیاری از موارد استفاده کرد. به عنوان مثال، می توان از آن برای تطبیق نمونه های صحنه جرم، آزمایش بیماری های ژنتیکی یا شناسایی یک گونه جدید استفاده کرد. اما اولین مرحله تجزیه و تحلیل DNA، استخراج DNA از نمونه ای است که قرار است مورد مطالعه قرار گیرد.

نمونه‌های DNA از انسان و بسیاری از حیوانات دیگر اغلب از سلول‌های خون یا پوست استخراج می‌شوند. ساده ترین راه برای جمع آوری سلول های پوست از انسان، مسواک زدن داخل گونه با یک سواب پنبه است. این سواب باکال نامیده می شود. “باکال” اصطلاحی است به معنای گونه یا دهان.

نمونه های DNA از حیوانات کوچک (مانند حشرات) یا از گیاهان را می توان از نمونه های بافت کوچک استخراج کرد.

تجزیه و تحلیل DNA به DNA خالص نیاز دارد. DNA در سلول ها قرار دارد. اما بسیاری از مواد دیگر نیز در سلول ها وجود دارد. به عنوان مثال، سلول ها همچنین حاوی غشاء و پروتئین هستند. برای به دست آوردن DNA خالص، تکنسین ها باید ابتدا این مواد ناخواسته را جدا کرده و حذف کنند.​

مراحل اساسی استخراج DNA

مراحل اساسی استخراج DNA صرف نظر از نوع سلول یکسان است.

• لیز سلولی

کلمه lysis به معنای جدا شدن است. در یک سلول، لیز زمانی اتفاق می افتد که غشاها از هم جدا شوند. سلول ها دارای یک غشای بیرونی به نام غشای سلولی هستند. آنها همچنین یک غشای داخلی دارند که DNA را احاطه کرده است. این غشای داخلی غشای هسته ای نامیده می شود.غشاهای سلولی از دو لایه لیپید (مولکول چربی) و پروتئین تشکیل شده است.

لیز شیمیایی یکی از راه‌های جدا کردن غشای سلولی و غشای هسته است. در لیز شیمیایی، یک تکنسین آزمایشگاه یک ماده شوینده به سلول اضافه می کند. (2) مواد شوینده مولکول های چربی را جدا می کند و باعث شکسته شدن غشاء می شود. (مواد شوینده به همین ترتیب ظروف را تمیز می کنند. به چربی ها (لیپیدها) می چسبند، که شستن ذرات چربی را با آب راحت تر می کند.

لیز فیزیکی همچنین می تواند به شکستن غشای سلولی کمک کند. این شامل آسیاب یا مخلوط کردن سلول ها است که غشای آنها را می شکند. لیز شیمیایی گاهی با لیز فیزیکی ترکیب می شود.

• رسوب DNA

پس از شکسته شدن سلول و غشای هسته، مولکول های چربی باید حذف شوند. یک تکنسین آزمایشگاه محلول نمک بسیار غلیظی را اضافه می کند. این باعث می شود که مواد شوینده و سایر مواد زائد سلولی، مانند پروتئین ها، از بین بروند  ،رسوب می کند. رسوب دادن به معنای تشکیل جامدی است که از محلول جدا می شود.

DNA در محلول مایع حل شده باقی می ماند. می توان آن را با سانتریفیوژ از زباله های سلولی جدا کرد. در سانتریفیوژ، محلول مایع با سرعت بالایی می چرخد ​​به طوری که رسوب به صورت گلوله در انتهای لوله جمع می شود. DNA که هنوز در مایع حل می شود، می تواند به یک لوله نمونه جدید منتقل شود. به طور متناوب، رسوب را می توان از محلول فیلتر کرد. به این ترتیب مایع حاوی DNA باقی می ماند.

DNA در هسته در اطراف پروتئین هایی به نام هیستون پیچیده شده است. این به سازماندهی DNA به کروموزوم کمک می کند. برای حذف پروتئین های هیستون، می توان یک پروتئاز اضافه کرد. پروتئاز آنزیمی است که پروتئین ها را تجزیه می کند.

• حذف DNA

اکنون DNA باید از محلول مایع خارج شود. DNA در آب محلول است. یعنی می تواند در آب حل شود. اما در صورت وجود الکل و نمک محلول نیست. تکنسین های آزمایشگاهی می توانند اتانول یا ایزوپروپیل الکل (الکل مالشی) را اضافه کنند تا DNA توده شده و یک رسوب سفید قابل مشاهده را تشکیل دهد. استفاده از الکل سرد بسیار مهم است زیرا امکان استخراج مقدار بیشتری از DNA را فراهم می کند. اگر الکل خیلی گرم باشد، ممکن است باعث دناتوره شدن [پررنگ] یا تجزیه DNA شود.

در طول سانتریفیوژ، DNA به یک گلوله متراکم می شود. وقتی الکل حذف شود، DNA نسبتاً خالص باقی می ماند!

انتخاب کیت مناسب استخراج DNA

انتخاب کیت استخراج DNA مناسب برای DNA با کیفیت بالا با حساس‌تر شدن تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی، مهم‌تر است که یک کیت استخراج DNA DNA با کیفیت بالا ارائه کند. تکنیک هایی مانند توالی یابی خودکار نیازمند DNA با خلوص بالا و حداقل سطوح آلاینده، به ویژه مواد بازدارنده است.

کلید یک کیت استخراج DNA موثر، محیط اتصال به DNA است. محیط باید به شدت DNA را در یک سطح بزرگ به هم متصل کند تا بازدهی بالایی داشته باشد. علاوه بر این، محیط های اتصال DNA باید اتصال ضعیفی به پروتئین ها و سایر مولکول ها نشان دهند، به طوری که پروتئین ها، RNA و مولکول های با وزن مولکولی کم را می توان از محیط اتصال تحت شرایط بافر کم نمک قبل از شستشوی DNA شسته شود. کیت های استخراج DNA برای پلاسمیدها بر خلاف استخراج DNA ژنومی، که در آن تمام DNA استخراج می شود، جداسازی DNA پلاسمید شامل جداسازی DNA پلاسمید دایره ای از DNA ژنومی باکتری است. علاوه بر این، اکثر DNA پلاسمید جدا شده باید برای افزایش کارایی در کاربردهای پایین دستی مانند ترانسفکشن، ابرپیچ باقی بماند.

روش های مختلفی برای جداسازی DNA پلاسمید وجود دارد. یک کیت استخراج DNA معمولی از نوعی لیز قلیایی و به دنبال آن انکوباسیون با ماتریس اتصال DNA، شستشو و سپس استفاده می کند. یک کیت استخراج DNA بهینه شده برای پلاسمیدها با استفاده از روش لیز قلیایی اصلاح شده دارای چندین مزیت از جمله:

1. خالص سازی سریع DNA با کیفیت بالا و آماده برای PCR، توالی یابی، شبیه سازی، و سایر کاربردهای پایین دست آلاینده هایی مانند DNA باکتریایی و پروتئین ها حذف می شوند. مانند فنل یا کلروفرم بدون نیاز به رسوب اتانول سانتریفیوژ رومیزی یا منیفولد خلاء ساده – بدون اولتراسانتریفیوژ
2. مقیاس کیت استخراج DNA پلاسمید مورد استفاده بستگی به مقدار ماده اولیه و بازده DNA پلاسمید مورد نیاز دارد. اکثر کیت ها در اندازه های آماده سازی مینی، میدی و ماکسی عرضه می شوند. اکثر برنامه ها از اندازه کیت کوچک، عمدتاً برای غربالگری استفاده می کنند. کیت midi برای تولید DNA پلاسمید کافی برای دستکاری های متعدد یا کاربردهای با حجم بالا مانند ساترن بلات یا الکتروفورز ژل میدان پالسی استفاده می شود. کیت های استخراج DNA برای ژنوم و سایر DNA پروتکل دقیق مورد استفاده با کیت استخراج DNA برای DNA ژنومی به منبع آن بستگی دارد. هر کیت استخراج DNA معمولاً پروتکل‌های لیز سلولی و شستشوی جایگزین را ارائه می‌کند که برای انواع سلول‌ها و بافت‌های رایج بهینه شده‌اند.
3. نمونه های محیطی اغلب دارای مواد زیادی هستند که برای کاربردهای پایین دست بازدارند و باید حذف شوند. به عنوان مثال، خاک حاوی سطوح بالایی از اسید هیومیک است که برای بسیاری از آنزیم ها از جمله Taq polymerases مهار می شود. بنابراین، یک کیت استخراج DNA برای جداسازی DNA باکتری از نمونه های خاک باید بتواند به طور موثر اسید هیومیک را از DNA باکتری شسته باشد.
4. علاوه بر DNA ژنومی، DNA میتوکندری (mtDNA) اغلب برای آزمایش های پزشکی قانونی تجزیه و تحلیل می شود. بنابراین، یک کیت استخراج DNA که برای استفاده پزشکی قانونی طراحی شده است، ممکن است برای افزایش بازده mtDNA دایره ای کوچک بهینه شود.
5. mtDNA مزایای متعددی برای پزشکی قانونی دارد. اکثر سلول ها صدها نسخه از ژنوم میتوکندری و فقط دو نسخه از DNA هسته ای دارند. این بدان معناست که در نمونه های بسیار کوچک یا نمونه هایی که دچار تخریب شده اند، احتمال بیشتری برای دریافت داده های مفید از نظر قانونی وجود دارد.

منابع

• DNA Extraction | Let’s Talk Science

https://letstalkscience.ca/educational-resources/backgrounders/dna-extraction#:~:text=DNA%20samples%20from%20humans%20and,is%20called%20a%20buccal%20swab.

• https://www.bio-rad.com/featured/en/dna-extraction-kit.html#:~:text=A%20typical%20DNA%20extraction%20kit,purification%20of%20high%2Dquality%20DNA

• DNA Extraction | Let’s Talk Science

https://letstalkscience.ca/educational-resources/backgrounders/dna-extraction#:~:text=DNA%20samples%20from%20humans%20and,is%20called%20a%20buccal%20swab.