واکنش زنجیره ای پلیمراز تودرتو (PCR) در شرایطی استفاده می شود که در آن لازم است حساسیت و/یا ویژگی PCR افزایش یابد، به عنوان مثال، هنگام تکثیر یک عضو خاص از یک خانواده ژن چندشکلی یا هنگام تکثیر یک کپی cDNA از mRNA موجود. با فراوانی بسیار کم در یک نمونه بالینی حاوی جمعیت ناهمگن انواع سلولی. Nested PCR معمولاً شامل دو واکنش تقویت متوالی است که هر کدام از یک جفت پرایمر متفاوت استفاده می کنند. محصول اولین واکنش تقویتی به عنوان الگوی PCR دوم استفاده می شود که توسط اولیگونوکلئوتیدهایی که در داخل جفت پرایمر اول قرار می گیرند، پرایم می شود. استفاده از دو جفت اولیگونوکلئوتید اجازه می دهد تا تعداد چرخه های بیشتری انجام شود و در نتیجه حساسیت PCR افزایش یابد. ویژگی بهبود یافته واکنش از اتصال دو مجموعه جداگانه پرایمر به یک الگوی هدف ناشی می شود. Nested PCR یک روش کارآمد برای تقویت بخش‌های قالب‌های طولانی است، اما به دانش توالی هدف نیاز دارد.

اولین مجموعه پرایمرها برای بازپخت به توالی های بالادستی از مجموعه دوم پرایمرها طراحی شده اند و در واکنش اولیه PCR استفاده می شوند.آمپلیکون های حاصل از اولین واکنش PCR به عنوان الگو برای مجموعه دوم پرایمرها و مرحله دوم تقویت استفاده می شود. حساسیت و ویژگی تقویت DNA ممکن است به طور قابل توجهی با این تکنیک افزایش یابد. با این حال، پتانسیل آلودگی انتقال واکنش معمولاً به دلیل دستکاری اضافی محصولات آمپلیکون نیز افزایش می‌یابد.

اولین مجموعه پرایمرها برای بازپخت به توالی های بالادست از مجموعه دوم پرایمرها طراحی شده است، در حالی که مجموعه دوم پرایمرها در داخل یا تو در تو نسبت به اولین مجموعه پرایمرها قرار دارند. اولین مجموعه پرایمرها که “پرایمرهای بیرونی” نیز نامیده می شوند، قطعه بزرگی از ژن را که به عنوان الگو در دور دوم PCR مورد استفاده قرار می گیرد، تقویت می کند و ناحیه کوچکتری از آمپلیکون را با استفاده از مجموعه دوم پرایمرها که به عنوان “پرایمرهای داخلی” نیز شناخته می شود، مورد هدف قرار می دهد. یا پرایمرهای تو در تو».

روش سنتی برای PCR تودرتو این بود که تعدادی چرخه PCR را با استفاده از اولین مجموعه پرایمرها انجام داد و سپس ظرف واکنش را باز کرد و مجموعه پرایمرهای تودرتو دوم را برای اجرای چرخه دوم PCR اضافه کرد. مشکل اصلی این روش آلودگی آمپلیکون در آزمایشگاه و در نتیجه از دست دادن ویژگی سنجش است. برای رسیدگی به این موضوع، واکنش‌های تک لوله‌ای تودرتو PCR (STNPCR) ایجاد شده‌اند که در آن هر دو مجموعه پرایمر به ظرف واکنش اولیه اضافه می‌شوند و یک PCR گسترده انجام می‌شود.

آمپلیکون‌های این سنجش PCR با الکتروفورز کردن مخلوط واکنش در ژل آگارز رنگ‌آمیزی با اتیدیوم برومید 2% همراه با نشانگر وزن مولکولی مشاهده می‌شوند.
مزیت – فایده – سود – منفعت
Nested PCR تقویت غیر اختصاصی توالی هدف را کاهش می دهد.

این به این دلیل است که پرایمرهای تو در تو، مکان های پرایمری را روی هیچ دیمر پرایمر یا آرتیفکت غیر اختصاصی تولید شده در PCR اولیه پیدا نمی کنند. پرایمرهای تو در تو فقط هر محصول خاصی را که در PCR اولیه تولید می شود پرایم می کنند، بنابراین ویژگی PCR حفظ می شود.

کاربردهای Nested PCR
برای بهبود حساسیت روش، PCR تودرتو در بسیاری از سنجش های PCR استفاده شده است. این به ویژه برای نمونه های اسید نوکلئیک غیربهینه، مانند نمونه های استخراج شده از بافت پارافین تثبیت شده با فرمالین مفید است.

PCR های تودرتو برای تشخیص میکروارگانیسم ها زمانی که در مقادیر بسیار کم وجود داشته باشند ارزشمند هستند. مثلا:

تشخیص ریکتزیا، بارتونلا و ارگانیسم های مشابه در خون (باکتریمی) و بافت ها،
تشخیص هرپس ویروس و انتروویروس در CSF و
تشخیص M. tuberculosis در نمونه خلط.

محدودیت ها
حساس به آلودگی: حساسیت شدید PCR تودرتو با مجموعه مشکلات خاص خود همراه است. این آزمایش به شدت مستعد آلودگی است زیرا زمان بیشتری برای دستکاری نمونه دارد. آلودگی بیشتر در هنگام انتقال محصول دور اول به لوله دوم برای دور دوم تقویت رخ می دهد.
پرهزینه: این روش PCR نیز پرهزینه تر است زیرا شامل استفاده از دو واکنش جداگانه برای رسیدن به یک نتیجه است. در صورت تکرار آزمایش ها در صورت وقوع آلودگی، هزینه به طور چشمگیری افزایش می یابد.

منابع:
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/nested-polymerase-chain-reaction#:~:text=Nested%20PCR%20is%20a%20modification,in%20an%20initial%20PCR%20reaction.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30710024/
https://microbeonline.com/nested-pcr-principle-applications/