تست سنجش تیول
26 آبان 1402 1402-09-20 21:29تست سنجش تیول
تست سنجش تیول
در موجودات زنده، گروه های تیول به صورت سیستئین آزاد، گلوتاتیون، سیستئین باقی مانده در پروتئین ها (مانند آلبومین) وجود دارند. گروههای تیول متصل به اتم کربن، توانایی احیاکنندگی قوی دارند و نقش مهمی در ظرفیت آنتیاکسیدانی برای حذف ROS (گونه های فعال اکسیژن) دارند. بر اساس یافته ها، برخی از بیماران، سطح پایین تیول پروتئین سرم را نشان می دهند. علاوه بر این، اکسیداسیون گروه های تیول پروتئین به ساختار سوم یا چهارم پروتئین کمک می کند. در نتیجه این گروه عاملی از اهمیت ویژه ای برخوردار است.
تست سنجش تیول مقدار SH را در نمونه با روش المن (Ellman) اندازه گیری می کند. معرف ویژه این روش با نام (DTNB: 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)) با گروه های تیول در نمونه های خون واکنش می دهد و رنگ زردی ایجاد می کند که حاصل ترکیب TNB2- (5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid) است. به این ترتیب شدت رنگ متناسب با گروه های تیول در نمونه های خون است. غلظت تیول را می توان با اندازه گیری جذب TNB2- در طول موج ۴۱۲ نانومتر (۳۸۰ نانومتر تا ۴۴۰ نانومتر) محاسبه کرد.
کمیسازی تحلیلی تیولها (این گروه عاملی همچنین به عنوان سولفیدریلها شناخته میشوند)، یک تکنیک ضروری و کاربردی در زمینههای بیوشیمی، فیزیولوژی و علم مواد است. تعیین مقادیر کمی گروه عاملی تیول دشوار است زیرا فاقد طول موج طیفسنجی منحصر به فرد با آنالیزهای استاندارد است (به عنوان مثال جذب UV-Visible، جذب مادون قرمز، رزونانس مغناطیسی هسته ای یا nuclear magnetic resonance و غیره) و بنابراین به راحتی در محیط های شیمیایی مختلف تحت الشعاع قرار می گیرد. در طول سالها، تکنیکهای مختلفی برای تعیین کمی غلظت تیول توسعه یافته است، مانند روش های الکتروشیمیایی، تشخیص با استفاده از نانومواد، پروبهای فتوردوکس (photo-redox)، سنجشهای شیمیایی کالریمتری، سنجشهای شیمیایی فلورسنت، روشهای بیوشیمیایی، طیفسنجی جرمی (mass spectrometry) و روشهای HPLC.
همانطور که اشاره شد پرکاربردترین روش سنجش کمی تیول روش المن با استفاده از معرف DTNB است. این سنجش توسط جورج المن در شرکت Dow Chemical در دهه ۱۹۵۰ با هدف اندازه گیری غلظت تیول در بافت بیولوژیکی توسعه یافت. او این کار را بر اساس مشاهدات قبلی مبنی بر اینکه دی سولفیدهای آروماتیک دارای کمبود الکترون تحت تبادل سریع با تیولهای آزاد قرار میگیرند تا یک تیول آروماتیک رنگی و یک هترودی سولفید ایجاد کنند. از آن زمان، DTNB به یک سنجش اساسی برای بیوشیمیست ها تبدیل شده است. این سنجش نیز مانند برخی تست های دیگر بدون نقص نیست. به عنوان مثال، عواملی مانند pH، غلظت نمک، حلالهای گوناگون، زمان واکنش و قرار گرفتن در معرض اکسیژن همگی بر دقت سنجش تیول تأثیر می گذارند.
سنجش شیمیایی کالریمتری دیگری که برای تیولها در سالهای گذشته مورد استفاده قرار گرفته است 4,4′-dipyridyl disulfide (که گاهی اوقات به عنوان Aldrithiol-4 و یا 4DPS نامیده میشود) است. در حالی که 4DPS به هیچ عنوان جایگزین استفاده از معرف DTNB نمی شود، ولی به خوبی کاستی های طیف شیمیایی (spectrochemical) و موارد مربوط به pH را رفع می کند.
مکانیسمهای DTNB و 4DPS به تبادل تیول-دی سولفید برای آزاد کردن کروموفوری که میتواند به روش اسپکتروفتومتری اندازهگیری شود، متکی است. این ویژگی باعث میشود کروموفورهای تبادل تیول-دی سولفید سنجشهای بسیار سادهای برای اندازهگیری اسپکتروفتومتری با استفاده از ابزار UV-Visible انجام دهند. ولی همانطور که اشاره شد این سنجش آزمایشگاهی عاری از خطا نیست. به عنوان مثال حداکثر جذب (λmax) در غلظتهای مختلف یونی و حلال های گوناگون تغییر میکند.
لازم به ذکر است اغلب پژوهش های انجام شده با استفاده از DTNB و 4DPS برای سنجش تیول در محیط های آبی و بستر های بیولوژیکی مورد استفاده قرار گرفته اند.
به عنوان جمع بندی نهایی می توان اشاره کرد که معرف المن را می توان برای اندازه گیری تیول های با جرم مولکولی کم مانند گلوتاتیون در محلول های خالص و نمونه های بیولوژیکی مانند خون استفاده کرد. همچنین این روش می تواند تعداد گروه های تیول روی پروتئین ها را اندازه گیری کند.