تعیین غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک
25 آبان 1402 1402-09-20 21:30تعیین غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک
تعیین غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک
اندازه گیری غلظت اسیدهای نوکلئیک با استفاده از روش های مختلفی انجام می گیرد که از مهم ترین آنها می توان به روش نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز اشاره کرد.
سنجشهای بیومولکولی که از مقادیر کمتری از مواد استفاده می کنند، به طور مداوم در حال توسعه هستند. این روش ها اغلب جایگزین استفاده از ابزارهای معمولی مبتنی بر کووت، برای تعیین غلظت اسید های نوکلئیک شده اند.
روش اندازه گیری نانودراپ ( NanoDrop ) با ترکیب فناوری فیبر نوری و خواص کشش سطحی طبیعی برای گرفتن و حفظ مقادیر بسیار دقیق نمونه مستقل از دستگاههای اندازه گیری سنتی مانند استفاده از کووت عمل میکند. علاوه بر این، این سیستم از طول مسیر کوتاه تری استفاده میکند که منجر به طیف وسیعی از اندازه گیری غلظت اسید نوکلئیک میشود که اساساً نیاز به ساخت رقتهای مختلف را از بین میبرد. کاهش حجم نمونه مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل طیف سنجی، همچنین گنجاندن مراحل کنترل کیفیت اضافی را تسهیل میکند، کارایی را افزایش میدهد و در نهایت منجر به اطمینان بیشتر از نتایج به دست آمده میشود.
نیاز به آنالیزهای فلورسنت با حساسیت بالا برای جرم های محدود نیز با پیشرفت های اخیر پدیدار شده است. بدین ترتیب با استفاده از فناوری نگهداری نمونه با حجم کم (microvolume sample retention)، اندازه گیریهای فلورسنت ممکن است حتی با ۲ میکرولیتر ماده انجام شود، که همین امر موجب می شود نیاز حجم سنجشهای فلورسنت به میزان قابل توجهی کاهش یابد. چنین واکنشیهایی اکنون با استفاده از یک فلورواسپکترومتر اختصاصی امکانپذیر است.
گاهی اوقات، دانستن غلظت دقیق یک نمونه اسید نوکلئیک ضروری است. دانستن غلظت دقیق، می تواند به جلوگیری از مصرف غیر ضروری، افزایش تکرارپذیری و استاندارد کردن بسیاری از پروتکل ها مانند توالی یابی کمک کند. کمی سازی و اندازه گیری نادرست می تواند تنوع در سنجش های مختلف را افزایش دهد که منجر به کاهش اطمینان به نتایج به دست آمده می شود. ژل الکتروفورز معمولاً در جداسازی و آنالیز اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود. بنابراین، جداسازی مولکولی می تواند به تجسم کیفیت و کمیت اسیدهای نوکلئیک کمک کند. علاوه بر این، جداسازی مولکولی می تواند برای تشخیص بیماری های ناشی از باکتری ها، ویروس ها و یا قارچ ها مورد استفاده قرار گیرد.
همانطور که اشاره شد روش متداول دیگری که برای تعیین غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ژل الکتروفورز آگارز است.
ژل الکتروفورز اسید نوکلئیک یک تکنیک بیولوژی مولکولی برای جداسازی، شناسایی و خالص سازی قطعات DNA و RNA بر اساس اندازه و بار آنهاست. در این روش، مولکولهای DNA و RNA با اعمال میدان الکتریکی برای حرکت اسیدهای نوکلئیک با بار منفی از طریق ژل آگارز یا پلی آکریل آمید جدا میشوند.
ژل مورد نظر به عنوان یک غربال عمل می کند و به مولکول های کوتاه و سبک تر اجازه می دهد تا سریع تر از مولکول های بلند و سنگین تر از منافذ ژل عبور کنند.
ژلهای آگارز بیشتر برای الکتروفورز DNA و RNA استفاده میشوند و میتوانند قطعات DNA از ۵۰ جفت باز (base pair) تا ۵۰۰۰۰ جفت باز را با استفاده از تکنیکهای الکتروفورتیک استاندارد جداسازی کنند.
ژل های پلی آکریل آمید محدوده جداسازی کمتری دارند و می توانند قطعات DNA کمتر از ~ ۵۰۰ جفت باز را با دقت و کیفیت بسیار بالا جداسازی کنند.
هم ژل آگارز و هم پلی آکریل آمید را می توان در سنجش جابجایی الکتروفورتیک (EMSA) برای مشخص کردن برهمکنش های پروتئین- اسید نوکلئیک استفاده کرد.
پس از الکتروفورز، مولکولهای DNA و RNA را میتوان با استفاده از رنگ ها یا اشعه ماوراء بنفش مشاهده کرد، از ژل استخراج و خالص کرد و یا یا برای بلاتکردن (لکه گذاری) انتقال داد. این روشها تکنیکهای آمادهسازی رایج در کلون کردن، PCR، طیفسنجی جرمی (mass spectrometry)، توالییابی نسل بعدی (next generation sequencing یا NGS) و لکه گذاری های Northern و Southern هستند.