Real-Time PCR

تکنیک‌های تقویت و تشخیص نوکلئیک اسید یکی از ارزشمندترین ابزارها در تحقیقات بیولوژیکی امروزی است. دانشمندان در تمام زمینه های علوم زیستی – تحقیقات پایه، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی، تشخیص و موارد دیگر – از این روش ها در طیف گسترده ای از کاربردها استفاده می کنند. برای برخی کاربردها، تشخیص کیفی اسید نوکلئیک کافی است. با این حال، برنامه های دیگر نیاز به تجزیه و تحلیل کمی دارند. Real-time PCR  که با نام  qPCR  نیز شناخته شده است را می توان برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی استفاده کرد. انتخاب بهترین روش برای کاربرد شما نیاز به دانش گسترده ای از این فناوری دارد. این بخش مروری بر زمان واقعی PCR، تکنیک‌های PCR  مثل تکنیک  RT-qPCR ، و انتخاب ابزارهایی  پیشنهادی معتبر را، ارائه می‌کند. همچنین  در رابطه با نکاتی برای مراحل جداسازی RNA مانند جمع آوری نمونه، استخراج RNA صحبت میشود .

Real-Time PCR چیست؟

در PCR معمولی، محصول DNA تقویت شده یا آمپلیکون در تجزیه و تحلیل نقطه پایانی شناسایی می شود. در زمان واقعی PCR، انباشت محصول تقویت با پیشرفت واکنش، در زمان واقعی، با کمی سازی محصول پس از هر چرخه اندازه گیری می شود.

گردش کار qPCR زیر مراحل Real-time PCR را مشخص می کند. ابتدا، واکنش‌های تقویت با معرف‌های PCR و پرایمرهای منحصربه‌فرد یا سفارشی تنظیم می‌شوند. سپس واکنش‌ها در ابزارهای Real-time PCR اجرا می‌شوند و داده‌های جمع‌آوری‌شده توسط نرم‌افزار ابزار اختصاصی آنالیز می‌شوند.

تشخیص Real-time محصولات PCR با گنجاندن یک مولکول گزارشگر فلورسنت در هر چاه واکنش فعال می شود که با افزایش مقدار DNA محصول، فلورسانس را افزایش می دهد. راشیمی فلورسانس استفاده شده برای این منظور شامل رنگ های اتصال به DNA و پرایمرها یا پروب های خاص توالی نشاندار شده با فلورسنت است. سیکلرهای حرارتی تخصصی مجهز به ماژول‌های تشخیص فلورسانس برای نظارت بر سیگنال فلورسانس هنگام تقویت استفاده می‌شوند. فلورسانس اندازه گیری شده متناسب با مقدار کل آمپلیکون است. تغییر در فلورسانس در طول زمان برای محاسبه مقدار آمپلیکون تولید شده در هر چرخه استفاده می شود.

مزیت اصلی Real-time PCR نسبت به PCR این است که Real-time PCR به شما امکان می دهد تعداد اولیه کپی های DNA الگو (توالی هدف تقویت) را با دقت و حساسیت بالا در محدوده دینامیکی گسترده تعیین کنید. نتایج Real-time PCR می تواند کیفی (وجود یا عدم وجود یک توالی) یا کمی (تعداد کپی) باشد. بنابراین PCR زمان واقعی کمی به عنوان تجزیه و تحلیل qPCR نیز شناخته می شود. در مقابل، PCR در بهترین حالت نیمه کمی است. علاوه بر این، داده‌های qPCR را می‌توان بدون الکتروفورز ژل ارزیابی کرد که منجر به کاهش زمان بنچ و افزایش توان عملیاتی می‌شود. در نهایت، چون واکنش‌های qPCR بی درنگ اجرا می‌شوند و داده‌ها در یک سیستم qPCR یکپارچه و لوله بسته ارزیابی می‌شوند، فرصت‌ها برای آلودگی کاهش می‌یابد و نیاز به دستکاری پس از تقویت در تجزیه و تحلیل qPCR حذف می‌شود.

کاربردهای سنجش زمان واقعی PCR/qPCR

سنجش زمان واقعی PCR/qPCR به ابزار انتخابی برای تعیین سریع و حساس و تعیین کمیت اسید نوکلئیک در نمونه‌های بیولوژیکی مختلف، با کاربردهای متنوعی مانند تجزیه و تحلیل بیان ژن، تشخیص ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی در غذا، و فنوتیپ‌سازی سرطان تبدیل شده است. .

در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، سنجش qPCR به طور گسترده برای اندازه‌گیری کمی تعداد کپی ژن (دوز ژن) در رده‌های سلولی تبدیل شده یا وجود ژن‌های جهش یافته استفاده می‌شود. در ترکیب با رونویسی معکوس PCR (RT-PCR)، سنجش qPCR می تواند برای تعیین کمیت دقیق تغییرات در بیان ژن، به عنوان مثال، افزایش یا کاهش بیان در پاسخ به شرایط مختلف محیطی یا درمان دارویی، با اندازه گیری تغییرات   سطوح mRNA در سلول استفاده شود.

عملکرد  Real-Time PCR

برای درک اینکه چگونه PCR بی درنگ کار می کند، آنالیز qPCR را با استفاده از یک نمودار تقویت معمولی نشان می دهیم (شکل 1). در این نمودار، تعداد چرخه های PCR روی محور x و فلورسانس حاصل از واکنش تقویت که متناسب با مقدار محصول تقویت شده در لوله است، روی محور y نشان داده شده است.

نمودار تقویت دو فاز را نشان می دهد، یک فاز نمایی و به دنبال آن یک فاز فلات غیر نمایی. در طول فاز نمایی، مقدار محصول PCR در هر سیکل تقریباً دو برابر می شود. با ادامه واکنش، اجزای واکنش مصرف می‌شوند و در نهایت یک یا چند جزء محدودکننده می‌شوند. در این مرحله، واکنش کند می شود و وارد فاز فلات می شود (چرخه های 28-40 در شکل 1).

شکل 1. نمودار تقویت.فلورسانس تفریق شده پایه در مقابل تعداد چرخه های PCR.

در ابتدا، فلورسانس در سطوح پس‌زمینه باقی می‌ماند، و افزایش فلورسانس قابل تشخیص نیست (چرخه‌های 1-18، شکل 1) حتی اگر محصول به صورت تصاعدی انباشته شود. در نهایت، محصول تقویت شده کافی برای تولید یک سیگنال فلورسانس قابل تشخیص جمع می شود. شماره چرخه ای که در آن این اتفاق می افتد، چرخه کمی یا Cq نامیده می شود. زیرا Cqمقدار در فاز نمایی اندازه‌گیری می‌شود که معرف‌ها محدود نباشند، qPCR بی درنگ می‌تواند برای محاسبه مطمئن و دقیق مقدار اولیه الگوی موجود در واکنش بر اساس تابع نمایی شناخته‌شده که پیشرفت واکنش را توصیف می‌کند، استفاده شود.

Cqیک واکنش عمدتاً با مقدار الگوی موجود در شروع واکنش تقویت تعیین می شود. اگر مقدار زیادی از الگو در شروع واکنش وجود داشته باشد، چرخه‌های تقویت نسبتا کمی برای جمع‌آوری محصول کافی برای ایجاد سیگنال فلورسانس در بالای پس‌زمینه مورد نیاز است. بنابراین، واکنش Cq کم یا زودرس خواهد داشت. در مقابل، اگر مقدار کمی از الگو در شروع واکنش وجود داشته باشد، چرخه های تقویت بیشتری برای افزایش سیگنال فلورسانس از پس زمینه مورد نیاز خواهد بود. بنابراین، واکنش Cq بالا یا دیررس خواهد داشت. این رابطه پایه و اساس جنبه کمی  Real-time PCR را تشکیل می دهد.

جداسازی RNA

1. مجموعه نمونه
   برای جداسازی   RNAو کمیت بیان ژن، مواد نمونه باید تا حد امکان همگن باشد. اگر نمونه بافت شما از انواع مختلف سلول تشکیل شده باشد، تعیین دقیق الگوی بیان ژن هدف شما ممکن است دشوار باشد. اگر نمونه ای ناهمگن دارید، از یکی از روش های متعددی که برای جداسازی و جداسازی انواع سلول های خاص موجود است، استفاده کنید، به عنوان مثال، تشریح بافت، بیوپسی سوزنی، و میکرودیسکشن با لیزر. سپس می توان از سلول های جمع آوری شده برای به دست آوردن نمونه های RNA استفاده کرد.
2. استخراج RNA
   RNA کل یا پلی(A+) را می توان برای اکثر برنامه های بلادرنگ RT-qPCR استفاده کرد. یکی از نکات مهم در کار با RNA حذف RNase ها در محلول ها، مواد مصرفی و ظروف آزمایشگاهی است. محلول های آماده بدون RNase را می توان خریداری کرد یا محلول های شما را می توان با دی اتیل پیروکربنات (DEPC) تصفیه کرد و سپس اتوکلاو کرد. RNaseها روی ظروف آزمایشگاهی نیز می‌توانند با درمان DEPC یا پخت در دمای 250 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت غیرفعال شوند.

نمونه‌های RNA آماده شده ممکن است برای جلوگیری از تقویت احتمالی DNA ژنومی آلوده، که می‌تواند منجر به تخمین بیش از حد تعداد کپی mRNA شود، نیاز به درمان با DNase داشته باشد. با این حال، هنگامی که مواد اولیه محدود است، درمان با DNase ممکن است توصیه نشود، زیرا دستکاری اضافی می تواند منجر به از دست دادن RNA شود. از تکثیر DNA ژنومی بالقوه آلوده می توان با طراحی آغازگرهای اختصاصی رونوشت جلوگیری کرد، به عنوان مثال، آغازگرهایی که در سراسر اتصالات اسپلایس گسترش یا تقویت می شوند.

تجزیه و تحلیل کمیت و کیفیت اسید نوکلئیک

کمی سازی دقیق اسید نوکلئیک برای تجزیه و تحلیل بیان ژن ضروری است، به ویژه زمانی که مقادیر RNA کل برای عادی سازی بیان ژن هدف استفاده می شود.  RNAغلظت و خلوص معمولاً با اندازه گیری نسبت جذب UV در 260 نانومتر و 280 نانومتر تعیین می شوند.

رونویسی معکوس کمی  RT-qPCR

دو روش برای تعیین کمیت بیان ژن توسط RT-qPCR موجود است: RT-qPCR دو مرحله ای و RT-qPCR یک مرحله ای. در هر دو مورد، RNA معکوس به  cDNA رونویسی می شود و سپس cDNA به عنوان الگو برای تقویت qPCR استفاده می شود.یک قدمودو قدمبه این موضوع اشاره کنید که آیا RT و تقویت زمان واقعی PCR در لوله های مشابه یا جداگانه انجام می شود. در روش دو مرحله‌ای، RNA ابتدا در واکنشی با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس به cDNA رونویسی می‌شود. سپس مقداری از cDNA حاصل به عنوان الگویی برای واکنش های qPCR متعدد استفاده می شود. در روش تک مرحله ای RT و qPCR در یک لوله انجام می شود.

qPCR/Real-Time PCR Instrumentation

یک سیستم تشخیص Real-time PCR شامل یک سیکلر حرارتی مجهز به یک ماژول تشخیص نوری برای اندازه گیری سیگنال فلورسانس تولید شده در طول هر چرخه تقویت به عنوان فلوروفور به دنباله هدف است.سیستم های تشخیص   PCR Bio-Radدارای سیکلرهای حرارتی با ماژول های قابل تعویض برای تشخیص تک پلکس و مولتی پلکس فلوروفورها و همچنین واحدهای  Real-time PCR ثابت. همه سیستم های qPCR دارای عملکرد گرادیان حرارتی هستند.

• منابع

• Real-Time Polymerase Chain Reaction – an overview | ScienceDirect Topics

https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/real-time-polymerase-chain-reaction

• What is Real-Time PCR (qPCR)? | Bio-Rad

https://www.bio-rad.com/en-ua/applications-technologies/what-real-time-pcr-qpcr?ID=LUSO4W8UU#:~:text=Real%2Dtime%20PCR/qPCR%20assays%20have%20become%20the%20tool%20of,in%20food%2C%20and%20cancer%20phenotyping.

• Real-time PCR | Functional genomics II

https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/functional-genomics-ii-common-technologies-and-data-analysis-methods/real-time-pcr/#:~:text=Real%2Dtime%20polymerase%20chain%20reaction,%2Dthroughput%20studies%20(1).

 ​