سنتز cDNA تولید DNA مکمل (cDNA) از یک الگوی RNA با رونویسی معکوس را توصیف می کند. ترانس کریپتازهای معکوس (RTs) از یک الگوی RNA و یک پرایمر مکمل RNA برای هدایت سنتز cDNA رشته اول استفاده می کنند که می تواند مستقیماً به عنوان یک الگو برای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده شود. این ترکیب رونویسی معکوس و PCR امکان تشخیص RNA های کم فراوانی در یک نمونه و تولید cDNA مربوطه را فراهم می کند و در نتیجه شبیه سازی ژن هایی که تکثیر کمی دارند را تسهیل می کند. در روشی دیگر، cDNA رشته اول را می توان با استفاده از DNA پلیمراز I و DNA لیگاز دو رشته ای ساخت. این محصولات واکنش را می توان برای شبیه سازی مستقیم بدون تقویت استفاده کرد. در این مورد، فعالیت RNase H، از RT یا به صورت برون زا، مورد نیاز است.

بسیاری از RT ها از تامین کنندگان تجاری در دسترس هستند.ترانس کریپتاز معکوس ویروس میلوبلاستوز پرندگان (AMV).و مولونی ویروس لوسمی موشی (M-MuLV، MMLV) رونوشت معکوس RT هایی هستند که معمولاً در تکنیک های زیست شناسی مولکولی استفاده می شوند.M-MuLV ترانس کریپتاز معکوس فاقد فعالیت اگزونوکلئاز 3′ → 5′ است.ProtoScript® II Reverse Transcriptaseیک ترانس کریپتاز معکوس M-MuLV نوترکیب با کاهش فعالیت RNase H و افزایش پایداری حرارتی است. می توان از آن برای سنتز cDNA رشته اول در دماهای بالاتر از نوع وحشی M-MuLV استفاده کرد. این آنزیم تا دمای 50 درجه سانتیگراد فعال است و ویژگی بالاتر، بازده بالاتر cDNA و محصول کاملتر cDNA با طول تا 12 کیلوبایت را ارائه می دهد.WarmStart RTx Reverse Transcriptaseیک دی‌ان‌ای پلیمراز هدایت‌شده با RNA با طراحی منحصربه‌فرد در سیلیکون است که با یک آپتامر متصل به برگشت‌پذیر همراه شده است که فعالیت آنزیم را در دمای زیر 40 درجه سانتی‌گراد مهار می‌کند. این آنزیم می تواند یک رشته DNA مکمل را که از یک پرایمر با استفاده از RNA (سنتز cDNA) یا DNA تک رشته ای به عنوان الگو شروع می شود، سنتز کند. RTx یک آنزیم قوی برای تشخیص RNA در واکنش های تقویتی است و به ویژه برای استفاده درLAMP (تقویت هم دما با واسطه حلقه). این تغییر قالب RT آنزیم مخلوط دارای یک RT است که پس از رسیدن به انتهای 5′ الگوی RNA، چند نوکلئوتید غیرقالب‌دار را اضافه می‌کند و فعالیت سوئیچینگ الگو را در واکنش RT ممکن می‌سازد. Luna Reverse Transcriptase درLuna RT-qPCR/qPCR محصولات دارای پایداری حرارتی بالاتری نسبت به بسیاری از RT های دیگر هستند و اجازه می دهند دمای واکنش بهینه 55 درجه سانتیگراد را فراهم کنند.
ملاحظات مهم هنگام انجام سنتز cDNA شامل نوع پرایمرها و نوع RTase مورد استفاده است. بسته به الگوی RNA و کاربرد پایین دست، سه نوع آغازگر برای شروع رونویسی معکوس استفاده می شود (پرایمرهای oligo dT، پرایمرهای تصادفی و آغازگرهای اختصاصی ژن). برای جلوگیری از نمایش بیش از حد cDNA سنتز شده از انتهای 5′ یا 3′ RNA (5′ یا 3′) و جلوگیری از فراوانی رونوشت‌های cDNA کوتاه شده، پرایمینگ دقیق مورد نیاز است. PCR Biosystems طیف وسیعی از محصولات انعطاف‌پذیر و راحت را برای سنتز cDNA ارائه می‌دهد، از جمله کیت‌های حاوی هگزامرهای تصادفی پیش‌آمیخته و الیگو(dT) لنگردار که برای تولید cDNA برای استفاده در آزمایش‌های PCR بلادرنگ بهینه‌سازی شده‌اند.
نوع RTase مورد استفاده مهم است زیرا این آنزیم ها می توانند در فعالیت ها و خواص عملکردی خود متفاوت باشند. همه محصولات سنتز cDNA PCR Biosystems حاوی یک ویروس مولونی لوسمی موش (MMLV RTase ) بسیار فعال هستند که به گونه‌ای مهندسی شده است که فعالیت RNase H کاهش یافته و پایداری حرارتی بیشتری نسبت به MMLV نوع وحشی داشته باشد، و ویژگی بالاتر، بازده بالاتر و محصول cDNA تمام طول بیشتری را ارائه می‌دهد. توانایی انجام واکنش‌ها در دماهای بالاتر می‌تواند هنگام برخورد با RNA که حاوی مقدار زیادی ساختار ثانویه است، بسیار مفید باشد.
نمای کلی سنتز cDNA سنتز DNA مکمل (cDNA) از RNA اولین قدم ضروری در بسیاری از کاربردهای مولکولی است. تجزیه و تحلیل بیان ژن، تشخیص پاتوژن و آزمایش ژنتیکی توسط PCR کمی زمان واقعی (qPCR) یا توالی یابی نسل بعدی (NGS) تنها چند نمونه از کاربردهایی هستند که نیاز به رونویسی RNA به cDNA در مرحله اولیه دارند. نتایج دقیق و دقیق با استفاده از این کاربردها نیازمند وفاداری بالا در سنتز cDNA است به طوری که کتابخانه cDNA به طور دقیق رونوشت های RNA اصلی را نشان می دهد. دو ملاحظه مهم برای انتخاب کیت سنتز cDNA، آنزیم ترانس کریپتاز معکوس و استراتژی آغازگر مورد استفاده برای شروع واکنش است. انتخاب آنزیم بر سرعت سنتز و وفاداری واکنش تأثیر می گذارد. راهبردهای آغازگر بر آنچه در واکنش رونویسی می شود تأثیر می گذارد و اگر بهینه نباشد، ممکن است منجر به یک کتابخانه ای شود که به طور دقیق رونوشت کامل را نشان نمی دهد.
در سنتز cDNA ترانس کریپتازهای معکوس مورد استفاده در زیست شناسی مولکولی، DNA پلیمرازهای وابسته به RNA نوترکیب هستند که تبدیل RNA به DNA را در واکنش سنتز cDNA رشته اول کاتالیز می کنند. این واکنش یک مولکول مارپیچ دوگانه هیبریدی RNA-DNA تولید می کند. ترانس کریپتازهای معکوس دارای یک دامنه RNase H با فعالیت اندوریبونوکلئاز هستند که به طور خاص RNA را هنگامی که قطعه RNA با DNA کمپلکس می شود، تجزیه می کند. تخریب RNA در یک مجموعه RNA-DNA تضمین می کند که قطعه RNA فقط یک بار رونویسی می شود و سوگیری رونویسی را کاهش می دهد و وفاداری واکنش را تضمین می کند.
اکثر کیت های رونویسی معکوس تجاری از رونوشت معکوس ویروس لوسمی موش مولونی (MMLV) یا رونوشت معکوس ویروس میلوبلاستوز پرندگان (AMV) استفاده می کنند. MMLV چندین مزیت نسبت به AMV دارد که مهمترین آنها نرخ خطای کمتر و نرخ پردازش بالاتر است. فرآیندی به تعداد واکنش های متوالی اشاره دارد که آنزیم می تواند قبل از آزادسازی الگوی RNA کاتالیز کند. اگرچه فعالیت RNase H MMLV کمتر از AMV است، اما برای کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی مفید است. فعالیت بالای RNase H می‌تواند منجر به تخریب محصول شود که منجر به کاهش رشته‌های cDNA تمام طول، به ویژه با زمان‌های گسترش طولانی می‌شود. روش‌های پرایم سنتز cDNA بر نتایج تأثیر می‌گذارند سنتز رشته اول cDNA از اولیگو(dT)، آغازگرهای تصادفی یا ترکیبی از این استراتژی‌ها برای آغاز واکنش رونویسی معکوس استفاده می‌کند. پرایمینگ یک واکنش با الیگو(dT) سنتز را ترجیحاً در انتهای ‘3 قطعه RNA آغاز می کند. اگر قطعه RNA حاوی مقدار قابل توجهی از ساختار ثانویه باشد، واکنش ممکن است زودتر از موعد خاتمه یابد، و در نتیجه رونوشت های تمام طول کمتری ایجاد شود و انتهای 5′ قطعه کمتر نمایش داده شود.
آغازگرهای تصادفی توالی الیگونوکلئوتیدی از شش یا بیشتر باز هستند. هر آغازگر تصادفی آرایش متفاوتی از پایه ها دارد که به آن پتانسیل آنیل شدن در بسیاری از نقاط تصادفی رونوشت RNA را می دهد و پوشش کامل رونوشت را تضمین می کند. با تغییر طول پرایمر به جای استفاده از هگزامرها، می توان از تمایل به تولید قطعات cDNA کوتاهتر و بایاس 3′ تا 5′ جلوگیری کرد. یک عیب بالقوه پرایمرهای تصادفی این است که می توانند به دلیل پرایمینگ داخلی منجر به تخمین بیش از حد تعداد کپی در qPCR استاندارد شوند که منجر به توالی های کوتاه و کوتاه می شود که سپس در دورهای بعدی تقویت بیش از حد نشان داده می شوند.
ترکیب پرایمرهای تصادفی و الیگو(dT) بر مضرات هر مکانیزم پرایمینگ غلبه می‌کند، زیرا از پرایمینگ از انتهای 3 برای رونوشت‌های cDNA با طول کامل‌تر و پرایمینگ تصادفی برای پوشش کامل RNA بدون بایاس 3′ تا 5’ بهره می‌برد.
کیت های سنتز Bio-Rad نمونه ای از کیت های پر مصرف در سنتز cDNA
Bio-Rad طیف کاملی از کیت های سنتز cDNA را متناسب با نیازهای کاربردی خاص ارائه می دهد. کیت های سنتز cDNA iScript دارای یک ترانس کریپتاز معکوس MMLV با فعالیت RNase H در فرمولاسیونی است که با ترکیبی از اولیگو(dT) و آغازگرهای تصادفی بهینه شده است. این کیت ها عملکرد عالی را در طیف وسیعی از RNA ورودی نشان می دهند و برای ساخت یک کتابخانه cDNA که به طور دقیق رونوشت اصلی را نشان می دهد ایده آل هستند. کیت سنتز cDNA Reliance دارای یک آنزیم کایمریک جدید است که برای غلبه بر مشکلات فرآیندی تجربه شده با رونوشت معکوس سنتی طراحی شده است، و این را به راه حل ایده آل برای نمونه های چالش برانگیز، مانند RNA تخریب شده از نمونه های بافت FFPE یا نمونه های حاوی بازدارنده های آنزیمی تبدیل می کند. هر دو کیت با ترکیبی بهینه از oligodT و پرایمرهای تصادفی فرموله شده اند تا نسبت محصول تمام قد را افزایش داده و بایاس 5′ یا 3′ را به حداقل برسانند. هر دو کیت همچنین دارای یک گزینه پرایمینگ توالی خاص برای کاربردهای اختصاصی ژن با ویژگی بالا هستند و حاوی بازدارنده ‌های قوی RNase برای جلوگیری از تخریب RNA توسط فعالیت‌های RNase برون‌زا هستند.