پرایمر یک توالی اسید نوکلئیک کوتاه است که نقطه شروعی را برای سنتز DNA فراهم می کند. در موجودات زنده، آغازگرها رشته های کوتاه RNA هستند. یک پرایمر باید توسط آنزیمی به نام پریماز که نوعی RNA پلیمراز است، قبل از تکرار DNA سنتز شود. سنتز پرایمر ضروری است زیرا آنزیم‌هایی که DNA را سنتز می‌کنند، که DNA پلیمراز نامیده می‌شوند، فقط می‌توانند نوکلئوتیدهای DNA جدید را به رشته‌ای از نوکلئوتیدها متصل کنند. بنابراین پرایمر برای پرایم کردن و ایجاد پایه ای برای سنتز DNA عمل می کند. پرایمرها قبل از تکمیل تکثیر DNA حذف می شوند و شکاف های موجود در توالی با DNA پلیمرازها پر می شوند. در آزمایشگاه، دانشمندان می‌توانند آغازگرهای DNA را با توالی‌های خاصی طراحی و سنتز کنند که به توالی‌های یک مولکول DNA تک رشته‌ای متصل می‌شوند. این پرایمرهای DNA معمولاً برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز برای کپی کردن قطعات DNA یا برای تعیین توالی DNA استفاده می شوند.

طراحی پرایمر کمی PCR (qPCR) یک مرحله حیاتی در هنگام تنظیم qPCR یا روش رونویسی-qPCR معکوس (RT-qPCR) برای تجزیه و تحلیل بیان ژن است. پرایمرهای qPCR که به خوبی آنیلینگ می شوند یا در طول تقویت به بیش از یک توالی آنیل (anneal) می شوند، می توانند به طور قابل توجهی بر کیفیت و قابلیت اطمینان نتایج شما تأثیر بگذارند.

اولین قدم در طراحی پرایمرها این است که توالی نوکلئوتیدی ژن مورد نظر خود را بدست آورید.

به پایگاه داده ژن Pubmed بروید و ژن مورد علاقه خود را جستجو کنید. سپس می توانید بر اساس گونه ها در گوشه سمت راست صفحه بعدی فیلتر کنید.

روی ژن مورد نظر خود کلیک کنید و به پایین پیمایش کنید تا دنباله مرجع NCBI (RefSeq) را برای ژن خود پیدا کنید (به عنوان مثال “NM_203483”). توجه داشته باشید که اگر ژن شما ایزوفرم های متفاوتی داشته باشد ممکن است چندین توالی وجود داشته باشد – مطمئن شوید که روی ایزوفرم مورد علاقه خود کلیک کرده اید.

روی نام کلیک کنید و در صفحه بعدی، پیوندی به “انتخاب آغازگرها” را در گوشه سمت راست صفحه در زیر “Analyse this sequence” مشاهده خواهید کرد. روی این لینک کلیک کنید تا به ابزار Primer-BLAST هدایت شوید.

Primer-Blast Tool
ابزار Primer-BLAST دارای پارامترها و گزینه های زیادی برای تنظیم است. بخش‌های بعدی شما را با هر یک از گزینه‌های موجود در ابزار آشنا می‌کند و توضیح می‌دهد که برای هر کدام چه چیزی و چرا تنظیم کنید.

پارامترهای پرایمرهای qPCR
این بخش برخی از تنظیمات اولیه پرایمرهای شما، از جمله اندازه محصول PCR و دمای ذوب را پوشش می دهد. همچنین گزینه ای برای گنجاندن توالی برای آغازگرهای معکوس یا رو به جلو وجود دارد.

پارامترهای آغازگر زیر را تنظیم کنید:

محصول PCR/اندازه آمپلیکون: برای تقویت کارآمد، پرایمرها را طوری طراحی کنید که طول آمپلیکون بین 70 تا 200 جفت باز باشد.
تعداد پرایمرهایی که باید برگردانده شوند: این بستگی به شما دارد، بسته به اینکه از بین چند گزینه می خواهید انتخاب کنید. طولی نمی کشد تا برنامه 10 جفت پرایمر طراحی کند، و این باید به شما شانس معقولی برای پیدا کردن یک جفت مناسب بدهد.
دمای ذوب: به عنوان یک قاعده، حداقل 60 درجه سانتیگراد و حداکثر 63 درجه سانتیگراد را هدف قرار دهید. دمای ذوب پرایمر ایده آل 60 درجه سانتی گراد است (با حداکثر اختلاف 3 درجه سانتی گراد در دمای ذوب، Tm، از دو آغازگر). برای تعیین این دماها می توانید از ماشین حساب Tm استفاده کنید.

انتخاب اگزون/اینترون
برای جلوگیری از تکثیر DNA ژنومی آلوده، پرایمرها را طوری طراحی کنید که نیمی از پرایمر به انتهای ‘3 یک اگزون و نیمی دیگر به انتهای ‘5 اگزون مجاور هیبرید شود.

برای انجام این کار، به سادگی گزینه “Primer must span an exon-exon junction” را انتخاب کنید. شما نیازی به تغییر تنظیمات دیگر ندارید.

پارامترهای بررسی ویژگی جفت پرایمر
از تنظیمات پیش فرض استفاده کنید. این برنامه از توالی mRNA RefSeq از ارگانیسمی که انتخاب کرده اید برای طراحی پرایمرها استفاده می کند.
هنگامی که تمام پارامترها تنظیم شدند، با کلیک بر روی “دریافت آغازگرها” لیستی از دنباله های پرایمر بالقوه رو به جلو و معکوس را برای انتخاب بازمی گرداند. ممکن است مدتی طول بکشد، اما صفحه به‌طور دوره‌ای به‌روزرسانی می‌شود تا زمان پس از ارسال را نشان دهد. به گزینه‌هایی که برنامه برگردانده است نگاهی بیندازید و به موارد زیر توجه ویژه داشته باشید:

مطمئن شوید که انتهای 3 پرایمر حاوی باقیمانده C یا G باشد زیرا باقیمانده‌های T و A راحت‌تر به روش غیر اختصاصی به DNA متصل می‌شوند.
برای اطمینان از حداکثر پایداری محصول، محتوای GC حدود 40 تا 60 درصد را هدف قرار دهید.
برای کاهش احتمال تشکیل پرایمر-دایمر از خود تکمیلی خودداری کنید. در حالت ایده آل، پرایمر باید ترکیبی تقریباً تصادفی از نوکلئوتیدها داشته باشد.
حالا، بهترین دو یا سه پرایمر را انتخاب کنید، سفارش دهید و تست کنید. موفق باشید!

منابع:
https://www.nature.com/scitable/definition/primer-305/#:~:text=A%20primer%20is%20a%20short,before%20DNA%20replication%20can%20occur.
https://bitesizebio.com/10041/designing-qpcr-primers/