شمارنده های سلولی ماشین هایی هستند که معمولاً خودکار هستند و برای شمارش سریع و مستقل سلول های زنده طراحی شده اند. در علوم زیستی، شمارنده های سلولی سلول‌ها را به دلایل مختلف با استفاده از روش‌های مختلف برای مرتب‌سازی و شمارش سلول‌هایی که ویژگی‌های مشابهی دارند،استفاده میکنند. آنها که معمولاً مرتب‌کننده‌های سلولی نامیده می‌شوند، زیرمجموعه‌ای مهم از فلوسیتومتری هستند و در بسیاری از تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی که در آن سلول‌ها نیاز به شناسایی و اندازه‌گیری کمی دارند، استفاده می‌شوند.

به عنوان مثال، یک نمونه بارز آشنا برای هر کسی که برنامه های پزشکی را تماشا می کند، شمارش کامل خون یا CBC است. تجزیه و تحلیل CBC باید به سرعت و با دقت انجام شود تا پزشکان تصمیمات مناسبی در مورد مراقبت از بیماران خود بگیرند . توانایی مرتب سازی و شمارش سلول های خونی مختلف  ، به طور خودکار در یک محیط آزمایشگاه بالینی ارزشمند است. شمارش خودکار سلول‌ها همچنین برای شمارش انواع سلول‌های دیگر مفید است و به آنها جایگاه مهمی در تنظیمات تحقیقاتی اساسی می‌دهد.

دلایل بسیار مهم برای شمارش انواع سلول

از روش‌های متعدد در زیست‌شناسی و پزشکی که نیاز به شمارش سلولی دارند، برخی از مهمترین کاربردها شامل محاسبه غلظت سلول‌های مختلف خون، تنظیم دوز سلول‌های تجویز شده برای بیمار سلول‌درمانی و تعیین غلظت عوامل بیماری‌زا در خون هنگام نظارت بر عفونت است.

در محیط آزمایشگاهی، شمارنده های سلولی برای محاسبه غلظت سلول ها برای تنظیم معرف های آزمایش بیولوژی مولکولی، بررسی سرعت رشد میکروارگانیسم ها، و محاسبه کسر سلول های مرده به زنده برای اندازه گیری زنده ماندن سلول ها استفاده می شود. ویژگی‌ها در میان شمارنده‌های سلولی خودکار مختلف متفاوت است و بر پارامترهای عملیاتی مانند اندازه نمونه، کمیت و نوع سلول‌های تجزیه ‌وتحلیل‌شده، مدیریت داده‌ها و توانایی تمایز بین سلول‌های زنده و مرده تأثیر می‌گذارد. از میان این پارامترها، یکی از مهم‌ترین پارامترها اندازه نمونه است، زیرا بدست آوردن نمونه‌های بافت و سلول بزرگ، به‌ویژه در کلینیک می‌تواند دشوار باشد. بنابراین، اکثر شمارنده های سلولی از حجم نمونه های کوچک استفاده می کنند و تعداد سلول ها را به عنوان معیار غلظت بیان می کنند.

یکی از رایج ترین کاربردهای شمارنده سلولی در تحقیقات پایه، در ارتباط با آزمایش های کشت سلولی در آزمایشگاه های زیست شناسی سلولی و مولکولی است. یک آزمایش کشت سلولی معمولی ممکن است شامل درمان یک نوع سلول خاص با معرف های مختلف برای اندازه گیری اثرات با استفاده از یک مولکول گزارشگر باشد که توسط شمارنده سلولی شناسایی و شمارش می شود. سلول‌های رده‌های سلولی و بافت‌های جدا شده نیز ممکن است نیاز به دسته‌بندی بر اساس نوع و شمارش داشته باشند.

استفاده از شمارنده سلولی در مطالعات بیان ژن

یکی دیگر از کاربردهای رایج، معاینه تغییرات ژن در یک بافت، به ویژه در زیرجمعیت های سلولی است. در این مورد، مرتب‌سازی و شمارش سلول‌ها بر اساس ویژگی‌های مختلف سلول‌ها است، برخی طبیعی و برخی شامل استفاده از پروب‌های خاص (Silveira).

مرتب‌کننده‌های سلولی فعال‌شده با فلورسانس را می‌توان برای شناسایی و مرتب‌سازی سلول‌ها بر اساس تقریباً هر مولکول سلولی استفاده کرد.

شمارنده‌های سلولی خودکار معمولاً از روش‌های مبتنی بر سیالیک برای جداسازی سلول‌های معلق در محلول پس از بارگیری نمونه استفاده می‌کنند، که ویژگی‌های مختلفی از جمله شکل سلول، ساختارهای داخلی و خارجی سلولی و تراکم سلول را تشخیص می‌دهند. شمارشگرهای سلولی همچنین می‌توانند برای شناسایی و شمارش سلول‌های خاص به‌طور خودکار بر اساس رنگ‌آمیزی سلولی، مانند پروب‌های فلورسنت شمارش‌شده توسط مرتب‌کننده‌های سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS؛ Bene) استفاده شوند. چسباندن برچسب‌های فلورسنت به انواع پروب‌ها، از جمله آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و الیگونوکلئوتیدهای مهندسی شده، به این معنی است که FACS می‌تواند برای شناسایی و مرتب‌سازی سلول‌ها بر اساس تقریباً هر مولکول سلولی مورد استفاده قرار گیرد و درجه بالایی از ویژگی را برای شناسایی سلولی فراهم می‌کند.

یک فناوری جدیدتر که می تواند برای تجزیه و تحلیل بیان ژن در بافت ها به عنوان معیاری برای فراوانی نسبی سلول مورد استفاده قرار گیرد، .سیستم تحلیل nCounter Pro است که قادر به غربالگری بیش از 800 رونوشت ژن در یک زمان است .nCounter Pro  از پروفایل های بیان ژن به عنوان نشانگرهای زیستی برای اندازه گیری فراوانی نوع سلولی نسبی در تومورها و سایر فرآیندهای بیماری استفاده می کند.

چند نوع شمارش سلول وجود دارد؟

دو روش شمارش سلولی  وجود دارد، دستی و خودکار. شمارنده های سلولی دستی نمونه های اصلی هستند و هنوز هم استفاده می شوند. آنها که به عنوان هموسیتومتر شناخته می شوند، به یک تکنسین آموزش دیده برای شمارش فیزیکی سلول ها در زیر میکروسکوپ نیاز دارند.

نوع دوم، خودکار ، شمارنده های سلولی هستند که برای شمارش سریع و مستقل سلول ها طراحی شده اند. گران‌تر و پیچیده‌تر از هموسیتومترها هستند. شمارنده‌های سلولی خودکار از سیستم‌های پیچیده‌ای برای افزایش قابلیت اطمینان و توان استفاده می‌کنند.

شمارش سلول بر اساس روش

روش شمارش سلولی  نیز دو نوع است: آنهایی که از تصاویر میکروسکوپ برای شمارش استفاده می کنند و روشی که در آنها سلول ها از یک آشکارساز  عبور می کنند. هر یک از این گروه‌ ها تمایل دارند با گروه ‌های دستی یا خودکار هماهنگ شوند. به عنوان مثال، شمارنده‌های مبتنی بر تصویر شامل شمارنده‌های دستی به‌علاوه برخی از شمارنده‌های خودکار هستند. همانطور که از نام آن مشخص است، شمارنده های مبتنی بر تصویر، سلول های یک تصویر را روی میکروسکوپ می شمارند. در مکانهایی که هموسیتومترها از چشمان انسان برای شمارش استفاده می کنند، شمارنده های خودکار مبتنی بر تصویر ، از نرم افزار تصویربرداری متصل به میکروسکوپ استفاده می کنند که امکان شمارش سریعتر را فراهم می کند.

شمارشگرهای سلولی مبتنی بر تصویر، تنها تعداد سلول‌هایی را که در یک میدان دید وجود دارد، حساب می‌کنند، که اگر تعداد کمی از سلول‌ها قابل مشاهده باشند، می‌توانند برون یابی را خطرناک کند.

بنابراین هنگامی که دستگاه از تصویر برون یابی می شود، دقت می تواند تحت تأثیر قرار گیرد، به خصوص اگر میدان دید مورد استفاده برای شمارش ، تعداد کمی سلول داشته باشد. .

رایج ترین انواع شمارنده های سلولی  و روش های شمارش عبارتند از:

·        سیتومترهای تصویری

سیتومتری تصویری قدیمی ترین شکل شمارش سلول است که از میکروسکوپ نوری برای تصویربرداری از تعداد زیادی سلول استفاده می کند. سلول ها معمولاً برای تقویت کنتراست یا شناسایی مولکول های خاص رنگ آمیزی می شوند. به طور سنتی، سلول ها در یک هموسیتومتر برای کمک به شمارش دستی مشاهده می شوند.

دوربین های دیجیتال اتوماسیون سیتومترهای تصویر را رایج کرده اند.

·        فلوسیتومترها

فلوسیتومترها از جریان کنترل‌شده محلولی از سلول‌های معلق استفاده می‌کنند تا سلول‌های منفرد را برای مشخص‌سازی به صورت اپتیکال یا از طریق تشخیص امپدانس الکتریکی تراز کنند .مولکول‌های خاص را می‌توان با رنگ‌آمیزی سلول‌ها با فلوئوروکروم‌هایی مشابه آنچه که گاهی در سیتومتری تصویر استفاده می‌شود، مشخص کرد. فلوسایتومترها توان عملیاتی بالاتری نسبت به سیتومترهای تصویری دارند.

·        مرتب کننده های سلولی

سورترهای سلولی زیرمجموعه ای از فلوسیتومترها هستند که سلول ها را بر اساس ویژگی های الکتریکی ذاتی آنها مرتب می کنند. مرتب سازی با ارتعاش مکانیکی حاصل می شود که جریان مایع حاوی سلول را به قطرات می شکند. قطرات به دست آمده حاوی یک بار الکتریکی وابسته به نوع سلول موجود در داخل هستند، که با انحراف آنها توسط یک میدان الکتریکی به ظروف مختلف، شمارش می شوند.

·        سیتومترهای تایم لپس

سیتومترهای تایم لپس مشاهده مداوم سلول ها را در داخل یک انکوباتور کشت سلولی معمولی با ترکیب میکروسکوپ تایم لپس، سیتومتری تصویر و منابع نوری غیر مولد گرما مانند دیودهای ساطع کننده نور برای درک دینامیک سلولی تسهیل می کنند. به ویژه برای آزمایش هایی که نیاز به جلوگیری از رنگ آمیزی سلول های زنده است که ممکن است بر نتایج تأثیر بگذارد مفید است.

·        هموسیتومتر

هموسیتومترها یک روش شمارش سلولی دستی هستند که از یک میکروسکوپ نوری، یک لام میکروسکوپ شبکه ای با چاه هایی با حجم مشخص و یک تکنسین آموزش دیده استفاده می کند. هموسیتومترها تا دهه 1950 روش استاندارد شمارش سلولی بودند.

 

یکی از جدیدترین ابزارهای شمارش سلول NanoString  ، سیستم آنالیز nCounter® Pro است . اگرچه از نظر فنی یک شمارنده سلولی نیست  ، nCounter Pro از پروتکل هیبریداسیون پروب های DNA بارکد شده برای بررسی سلول های خاص استفاده می کند

 

شمارش سلول با هموسیتومتر

بسیاری از کاربردهای بیولوژیکی که از سلول‌ها استفاده می‌کنند، مانند میکروبیولوژی، کشت سلولی و  تست های خونی، نیازمند تعیین غلظت سلولی برای آزمایش‌های خود هستند.

شمارش سلول در واقع کاملاً ساده است و به یک محفظه شمارش به نام هموسیتومتر نیاز دارد، دستگاهی که توسط آناتومیست فرانسوی قرن نوزدهم اختراع شد.لویی چارلز مالاسز برای انجام شمارش سلول های خونی

یک هموسیتومتر از یک لام میکروسکوپ شیشه ای ضخیم با شبکه ای از خطوط عمود بر روی وسط تشکیل شده است. شبکه دارای ابعاد مشخصی است به طوری که مساحت تحت پوشش خطوط مشخص است که امکان شمارش تعداد سلول ها در حجم مشخصی از محلول را فراهم می کند.

متداول ترین نوع هموسیتومتر دارای شکل H است که در وسط آن حک شده است که دو سطح جدا از شبکه صیقلی آینه مانند را در بر می گیرد و ناحیه نصب لغزش پوشش را فراهم می کند (شکل 1).

یک هموسیتومتر کلاسیک

استفاده از هموسیتومتر در چهار مرحله ساده

1)     نمونه خود را با تریپان آبی رقیق کنید

تریپان بلو لکه ای است که به شما امکان می دهد سلول های مرده را از سلول های زنده تشخیص دهید. هنگامی که با نمونه سلول شما مخلوط می شود، سلول های مرده توسط رنگ آبی رنگ می شوند، به این معنی که شما می توانید تنها سلول هایی را که  زنده هستند، بشمارید. شما می توانید نمونه خود را با تریپان آبی به هر نسبتی رقیق کنید، اما نسبت 1:1 رایج ترین است. از رقت‌هایی که استفاده می‌کنید، حتماً آن را یادداشت کنید زیرا برای محاسبه نهایی خود به آن نیاز دارید.

2)     بارگذاری هموسیتومتر

قبل از شروع، اطمینان حاصل کنید که هموسیتومتر و هم لاستیک آن با پاک کردن ذرات گرد و غبار با کاغذ لنز تمیز هستند. روکش های مورد استفاده برای نصب بر روی هموسیتومترها به طور ویژه ساخته شده اند تا ضخیم تر از روکش های میکروسکوپی معمولی باشند زیرا باید بتوانند بر کشش سطحی یک قطره مایع غلبه کنند.

قبل از بارگذاری سوسپانسیون سلولی، ورقه را روی سطح شمارش قرار دهید. سپس نوک پیپت را به همراه نمونه خود در یکی از چاه های V شکل قرار دهید و به آرامی نمونه را خارج کنید. ناحیه زیر روکش با عمل مویرگی پر می شود.

مایع کافی باید وارد شود تا سطح آینه ای فقط پوشانده شود، معمولاً حدود 10 میکرولیتر، اما سطح را بیش از حد پر نکنید. می توانید دو نمونه را روی یک هموسیتومتر، یکی در هر دو شبکه بارگذاری کنید.

سپس هموسیتومتر بارگذاری شده روی مرحله میکروسکوپ قرار می گیرد و شبکه شمارش با توان کم در کانون توجه قرار می گیرد. اجازه دهید نمونه برای چند دقیقه ته نشین شود و از جابجایی روکش پرهیز کنید زیرا ممکن است حباب های هوا ایجاد کند و شمارش را دشوار کند.

3)    شمارش سلول ها در هموسیتومتر

شبکه کامل روی هموسیتومتر شامل 9 مربع است که هر مربع 1 میلی متر است ^. ناحیه شمارش مرکزی هموسیتومتر شامل 25 مربع بزرگ و هر مربع بزرگ دارای 16 مربع کوچکتر است.

هنگام شمارش سلول‌هایی که روی یک خط یا خط بیرونی همپوشانی دارند، فقط آن سلول‌ها را در خط بالا یا سمت راست مربع بزرگ بشمارید تا از دوبار شمارش سلول‌ها اجتناب کنید. سوسپانسیون ها باید به اندازه ای رقیق باشند که سلول ها یا سایر ذرات روی شبکه روی هم قرار نگیرند و باید به طور یکنواخت توزیع شوند.

 

برای انجام شمارش، بزرگنمایی مورد نیاز برای تشخیص نوع سلول مورد نظر را تعیین کنید و به طور سیستماتیک سلول ها را در مربع های انتخاب شده بشمارید تا تعداد کل تقریباً 100 سلول باشد،( حداقل تعداد سلول های مورد نیاز برای یک شمارش از نظر آماری معنی دار).

برای سلول‌های بزرگ، می‌توانید به سادگی سلول‌های داخل چهار مربع گوشه بزرگ (شکل 3B–E) و مربع میانی (شکل 3A) را بشمارید. برای تعلیق متراکم سلول‌های کوچک، ممکن است بخواهید سلول‌ها را در چهار مربع بیرونی و میانی مربع مرکزی بشمارید (شکل 3A) یا یک سوسپانسیون رقیق‌تر بسازید.

به خاطر داشته باشید که اگر یک سلول روی یک خط همپوشانی دارد، آن را به عنوان “in” در صورت همپوشانی با خط بالا یا سمت راست و “خارج” اگر با خط پایین یا سمت چپ همپوشانی دارد، بشمارید (شکل 3F).

4)     محاسبه غلظت سلولی

با استفاده از فرمول زیر می توانید غلظت سلولی خود را محاسبه کنید:

کل سلول در میلی لیتر = (کل سلول های شمارش شده x فاکتور رقت x 10000 سلول در میلی لیتر) / تعداد مربع های شمارش شده

بنابراین، برای مثال، اگر نمونه خود را 1:1 با آبی تریپان رقیق کرده باشید (ضریب رقت در این مورد 2 است)، و 325 سلول را در چهار گوشه مربع به اضافه مربع بزرگ مرکزی بشمارید (تعداد مربع های شمارش شده 5 است)، سپس:

Total cells/ml = (325 cells x 2 x 10,000 cells/ml)/ 5 = 130 x 10⁴ cells/ml

اگر می خواهید بدانید چند سلول در نمونه اصلی خود دارید، فقط غلظت سلول را در حجم کل نمونه ضرب کنید. به عنوان مثال، اگر حجم نمونه اصلی شما 5 میلی لیتر است، پس:

 

Total cells in sample = 130 x 10⁴ cells/ml x 5 ml = 650 x 10⁴ cells

 

 

 

منابع

 

• https://nanostring.com/blog/how-many-types-of-cell-counters-are-there/

 

• https://nanostring.com/blog/what-is-a-cell-counter-used-for/

 

• https://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/

 

• https://logosbio.com/how-to-count-cells-an-overview-of-cell-counting-methods/

 

 

• با سپاس و قدردانی فراوان از مجموعه زیست ژن بافت

 

 

​