بررسی آپوپتوز
آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول مکانیسم مهم هوموستاز سلولی است. محرکهای فیزیولوژیک و پاتولوژیک سبب ایجاد آپوپتوز میشوند. اختلال در آپوپتوز منجر به بیماریهای مختلف از قبیل بیماری خود ایمنی، سرطان، مقاومت تومور به دارو و ایدز میگردد. برای بررسی آپوپتوز از روشهای مختلفی استفاده میشود. روشهای متداول بررسی آپوپتوز عبارتند از بررسی سیتوتوکسیسیتی، تغییرات مورفولوژی، الگوی نردبانی DNA، روش TUNEL و فلوسیتومتری. در روشهای بررسی آپوپتوز انتخاب روش به سیستم سلولی، ماهیت ماده القاء کننده آپوپتوز و اطلاعاتی مورد نظر و محدودیت های تکنیکی بستگی دارد.
جهت سنجش آپوپتوز و بررسی مکانیزم آن روشهای متعددی بر مبنای تغییرات مورفولوژیک و بیوشیمیایی سلولهای آپوپتوزی طراحی و معرفی شدهاند مهمترین نکتهای که میبایست در نظر گرفته شود،انتخاب درست تکنیک سنجش آپوپتوز بر مبنای نوع مطالعه روی سلول یا بافت، القا کننده مورد نظر، مکانیزم مورد بررسی و سازگاری حساسیت و اختصاصی بودن نتایج بر مبنای تعداد سلول یا غلظت آنالیز مورد سنجش است.
۱_بررسی سیتوتوکسیسیتی: بررسی سیتوتوکسیسیتی اولین گام در بررسی آپوپتوز است. در این روش میزان مرگ سلولی مورد ارزیابی قرار میگیرد. این روش قادر به تمایز آپوپتوز از نکروز نیست و با بررسی درصد سولهای زنده یا مرده نسبت به گروه شاهد به دست میآید. دو روش معمول برای بررسی آن روش MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو است.
۲_تغییرات مورفولوژی: تغییرات مورفولوژیکی در روند آپوپتوز عبارتند از چروک شدن سلول، تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن هسته و تشکیل اجسام آپوپتوتیک. ارزیابی مورفولوژیکی نقش کلیدی در مطالعات مرگ سلولی دارد و نیازمند مهارت بالا میباشد.این ارزیابی به وسیله میکروسکوپ (نوری، الکترونی یا فلورسانس) انجام میشود.
۳_فراگمنتاسیون DNA که به روش TUNEL یا ISEL انجام میشود. روش ISEL نسبت به TUNEL وقت گیرتر بوده و حساسیت کمتری دارد.
۴_الگوی نردبانی DNA: در این روش DNA از سلول یا هموژن بافتی استخراج و سپس در ژل آگاروز الکتروفورز میشود. الگوی نردبانی DNA در فرایند آپوپتوز مشاهده میشود. محدودیت این روش این است که برای مشاهده الگوی نردبانی میزان بالای DNA نیاز است.
۵_فلوسایتومتری: فلوسایتومتری روشی است که طی آن جریان یکنواخت و خطی از سلولها در حضور ماده نشاندار فلورسانس در مجرای خوانش دستگاه قرار میگیرند و توسط تابش نور لیزر تحریک میشوند. بر اساس نوع ماده نشاندار فلورسانس نشر ساطع میشود.
اساس این روش بر این مبنا استوار است که در طی مراحل اولیه در نیمه داخلی غشا وجود دارد به نیمه خارجی غشا منتقل میشود که این عمل به دلیل اختلال در آنزیم ترانسلوکاز وابسته به ATP و یا فعال شدن سیستم های آنزیمی دیگر میباشد.
به طور کل میتوان نتیجه گرفت که در بررسی آپوپتوز یک روش به تنهایی برای اثبات آن کافی نیست انتخاب روش به سیستم سلولی ماهیت ماده القا کننده آپوپتوز و اطلاعاتی که به دنبال آن هستیم همچنین محدودیتهای تکنیکی بستگی دارد.
