استخراج DNA و RNA از سلول، بافت و خون
استخراج اسیدهای نوکلئیک DNA و RNA یکی از پایه ترین تکنیک هایی است که هر فردی که در حوزه ژنتیک وارد شده باید بیاموزد و این تکنیک بسته اینکه ترکیب استخراجی RNA باشد یا DNA، خلوص آن خیلی مهم باشد یا نه و همچنین استخراج از بافت و یا سلول انجام می شود، همه مواردی هستند که در انتخاب تکنیک مورد نظر مؤثر است.
در درجه اول استخراج موثر نوکلئیک اسید به چهار مرحله کلیدی نیاز دارد.
اولین و مهمترین مرحله که برای آنالیز و بررسی کیتها وجود دارد این است که بدانید این سلول از چه دیوارههایی تشکیل شده و چه ساختاری دارد زیرا نمیتوان کیتی ساخت که بتواند هر دو بافت گیاهی و جانوری را استخراج کند.
۱ Disruption- سلولها و بافتها : در این مرحله نمونه ابتدا تحت لیز سلولی قرار میگیرد تا غشاهای لیپیدی مختلف اطراف نوکلئیک اسیدها حذف شوند. چهار روش اساسی که به طور معمول در همه کیتها استفاده میشود شامل روش زیستی، فیزیکی، شیمیایی و مکانیکی میباشد.
از دیگر روشهایی که به کار میرود oil press ، هموژناسیون، bead milling و انفجار بخار میباشد.
۲.دناتوراسیون کمپلکس های نوکلئوپروتئینی : همانطور که میدانید نوکلوئیک اسیدها به یک سری پروتئینها متصل اند. گوانیدین یک خاصیتی دارد که نوکلئوپروتئینها را نیز دناتوره میکند. به عبارتی پروتئینهای چسبیده به DNA را نیز جدا میکند و باعث چسبیدن نمونه به ذرات نانومگنت میشود که میتوان از این روش استفاده کرد.
۳.حذف آلودگی: در این مرحله محلولی پر از پروتئین، کربوهیدرات یا لیپید داریم که نیاز به حذف آنهاست. در این مرحله میتوان از خاصیت چگالی استفاده کرد. برای مثال اگر از فنول کلروفرم استفاده کنیم چند لایه متفاوت را ایجاد میکند که در ادامه بعد از سانتریفیوژ لیپیدها و کربوهیدراتها ته نشین میشوند و محلول به صورت سه لایه در میآید. در لایه وسط DNA قرار دارد و ممکن است پروتئین نیز همراه آن باشد.
۴.رسوب نوکلئیک اسید: RNA و DNA درون محلول جدا شدند، اما میخواهیم این RNA یا DNA که بصورت محلول هستند، به حالت رسوب درآیند تا آنها را از محلول جدا کنیم. که برای اینکار میتوان از اتانول، Isopropanol ، Spin column و … استفاده کرد.
یکسری از تفاوت هایی که میان استخراج DNA و RNA وجود دارد :
۱.محلول بودن در PH های متفاوت: RNAها در PH اسیدی و DNA در PH قلیایی محلول است.
۲.آنزیم DNase برای شروع فعالیت نیاز به به یون دارد اما RNase بدون نیاز به یون در هر محلولی شروع به فعالیت میکند.
۳. استخراج RNA و همینطور نگهداری آن باید در فضای سرد انجام شود، زیرا پایداری کمتری دارد.
استخراج DNA
برای استخراج دیان پروتکلهای متفاوتی وجود دارد اما باید دقت شود که پروتکل مورد استفاده از یک منبع مورد اعتماد باشد.
متد های فراوانی برای استخراج DNA وجود دارد از جمله salting out,phenol chloroform, organic solvents, Anion exchange, magnetic beads,Glass milk,silica resin method,و …
این نکته حائز اهمیت است که بسته به نوع سلول و بافت نیز روش های مختلفی را باید بکار برد.
استخراج RNAنسبت به DNAسختتر و مشکلتر است. شرایط باید کاملاً RNase FREE باشد یعنی محصولاتی که استفاده میشود حاوی آنزیم نباشند محلی که کار انجام میشود باید تمیز عفونی شده باشد.
گام های اساسی در استخراج RNA
۱. نمونهها ابتدا در محلول گوانیدیوم تیوسیانات همگن و لیز میشوند.
۲. فنول، سدیم استات و کلرفرم اضافه شده و سانتریفیوژ صورت میگیرد.
۳. محلول به سه فاز تقسیم شده که RNA در فاز رویی قرار دارد.
۴. لایه رویی برداشته میشود و به آن ایزوپروپانول اضافه میشود.
استخراج DNA یا RNA از خون
به منظور استخراج DNA از خون روش های متفاوتی وجود دارد و بسته به کیت مورد استفاده یا روشی که بکار گرفته میشود متفاوت است اما اصول کلی یکسان بوده و به طور کل میتوان گفت در ابتدای امر نیاز به لیز RBC و جداسازی گلبول های سفید میباشد.
