بررسی آلودگی میکروبی در نمونه ها
دلایل آلودگی های آزمایشگاهی
ممکن است عفونت فرد یا میزبانی که عفونی می شود به وسیله محیط، عوامل فیزیکی، عوامل عفونی، حیوانات و یا حشرات از راه های مختلف به وجود آید.
در آزمایشگاه هایی که با حیوانات سر و کار دارند، خطر عفونت از حیوان به انسان فوق العاده زیاد است. گزارش های فراوانی در انتقال بیماری از شامپانزه به انسان در هنگام کار منتشر شده است. تقریبا در حدود صد بیماری است که میتواند از حیوان به انسان منتقل گردد، ولی تعدادی از بیماری های مشترک انسان و دام است که از حیواناتی که به طور طبیعی آلوده شده اند می توانند به انسان منتقل گردند.
از آن جمله: کوریومننژیت لنفوسیتیک، هپاتیت عفونی، تب پنجه گربه، بیماری نیوکاسل، پسیتاکوزیس، ویروس B میمون لپتوسپیروزیس، سل، مالاریا، آمبیاز، شیگلوزیس و عفونت های استرپتوکوکی و استافیلوکوکی.
عفونت منتقله به وسیله حیوانات ممکن است از طریق گاز گرفتن، چنگ زدن و یا فضولات و باقیمانده مواد غذایی در قفس ها و یا از راه تنفسی به وسیله حیواناتی که سرفه می کنند به کارمندان آزمایشگاه منتقل گردند. اگر حیواناتی برای بررسی میکروارگانیسم هایی که از طریق آئروسل منتقل می گردند تحت آزمایش باشند، احتمال دارد که میکروارگانیسم ها از راه پوست آن ها در هوا منتقل شود و سبب آلودگی کارکنان بخش حیوانات گردد.
همان طور که اشاره شد، مهمترین راه های سرایت و انتقال میکروارگانیسم در محیط آزمایشگاه عبارت است از:
1. تنفس هوای آلوده (Air Borne)
ذرات ریز «آئروسل» از ظروف محتوی مواد عفونی به طور خیلی ساده با برداشتن درب آن ها، استفاده از سواب برای برداشت نمونه و با استفاده از لوپ ممکن است در هوا پراکنده گردد. حرارت دادن سر سوزن ها در حالی که هنوز مواد مایع در آن قرار دارد ذرات آئروسل ایجاد می کند. شکستن لوله ها در داخل سانتریفوژ نیز یک حادثه خطرناک است.
معمولا عوامل میکروبی که در فضای آزمایشگاه پخش می شوند بیشترین خطر را برای کارمندان به وجود می آورند. بنابراین تجزیه هوای آزمایشگاه هرازگاهی بسیار ضروری است. در این رابطه می توان یا از طریق نمونه برداری هوای داخل اتاق ها اقدام کرد و یا از طریق استفاده از سواب.
در طریق نخست از وسایل مکنده هوا که بتواند در هر دقیقه ۲۸ لیتر هوا را نمونه برداری کند، استفاده می شود. این دستگاه دارای ۳۴۰ دریچه کوچک بوده که هوا به وسیله آن مکیده می شود و سپس بلافاصله یک تا دو میلیمتری بر بالای بوات پتری محتوی نوتریون آگار قرار داده می شود. پلیت ها را ۳۶ تا ۴۸ ساعت در حرارت ۳۰ سانتیگراد (۸۶ درجه فارنهایت) قرار داده، سپس باکتری ها را شمارش و تعداد کلنی های موجود در فضای آزمایشگاه و انواع آن را مشخص می نماید.
با استفاده از سواب آغشته به نوتریون براث نیز عینا می توان وضع آلودگی محیط آزمایشگاه را مشخص نمود.
2. بلعیدن میکروب ها
یکی از راه های ورود میکروب به بدن از طریق خوردن آن هاست. استفاده از دهان برای پیپت کردن محلول های میکروبی، بی دقتی در شستن دست بعد از تماس با نمونه های میکروبی، گذاشتن مداد و یا اشیاء دیگری که روی میزهای آلوده قرار داشته در دهان، گذاشتن سیگار بر روی میزهای آزمایشگاه و سپس استفاده از آن، خوردن و آشامیدن در داخل محیط های آلوده از راه های ورود میکروب به بدن است.
3. ورود مستقیم میکروب به بدن (Direct Inoculation)
وسایل تیز مانند سوزن و یا شیشه های شکسته ممکن است سبب جراحت در پوست شده و ورود مستقیم میکروب به بدن را تسهیل کند. همچنین میکروارگانیسم ها ممکن است از راه خراش های کوچک، محل خاراندن، کونژونکتویت چشم، و یا بافت های مخاطی دیگر مستقیم وارد بدن گردند و ایجاد عفونت نمایند.
ناقلین میتس ها، کنه، پشه ها و سایر پارازیت های پوستی ممکن است منابع بالقوه خطرناک برای انتقال عفونت و ایجاد آلودگی در کارکنان آزمایشگاه ها بخصوص هنگامی که با حیوانات آزمایشگاه کار می کنند، باشند.
4. دست زدن و حمل نمونه ها
نمونه هایی که قسمت خارجی ظرف بشدت آلوده است، هیچ گاه نباید مورد قبول بخش پذیرش نمونه ها قرار گیرد، در تمام موارد باید از دستکش های یکبار مصرف برای گرفتن نمونه ها استفاده شود.
برای حمل نمونه ها از مراکز دور دست، مانند خانه های بهداشت، مراکز بهداشتی و درمانی به مراکز آزمایشگاهی نباید از ظروفی استفاده کرد که هیچ گونه تراوشی به خارج نداشته باشد تا سبب آلودگی گردد.
کلیه نمونه ها باید در داخل هود بیولوژیک باز شود.هنگام سانتریفوژ کردن باید درب لوله ها بسته باشد.
5. کارکردن با نمونه های آزمایشگاهی
یکی از مهمترین منابع خطر برای کارکنان آزمایشگاه هنگام کار با نمونه های آزمایشی است. دقت در نکات زیر از خطرات احتمالی می کاهد.
کلیه نمونه ها و کشت ها باید به عنوان منبع بالقوه خطرناک تلقی شود و در تمام موارد از روش های ضد عفونی (Aseptic) پیروی شود.هنگام حمل ونقل تعداد زیادی پلیت، آنها را در جا پلیتی مخصوص باید قرار داد و همچنین لوله ها را در جا لوله ای مخصوص قرار داد.برای جلوگیری از ایجاد ذرات محتوی میکروب در استریل کردن سوزن ها و لوپ باید دقت کرد.
قبل و بعد از شروع به کار، میز محل کار باید با محلول ۵ /۲ درصد «آمفیل» با محلول مناسب دیگر ضدعفونی شود.
نکات ایمنی هنگام کار با نمونه های بخش میکروب شناسی
آزمایشگاه میکوباکتریولوژی دارای مقررات خاصی است که رعایت آن جدا توصیه می شود زیرا به دلیل ساختار خاص مایکوباکتری ها و مقاومت آن ها در مقابل مواد شیمیایی و مواد ضد عفونی کننده با دیگر باکتری ها فرق اساسی دارد.
- هیچ عمل میکو باکتریولوژی در آزمایشگاه فاقدS.C (هود بیولوژیک) نباید انجام گیرد.
- آزمایشگاه ها باید به دو قسمت جداگانه پاک (clean) و آلوده (contaminated) تقسیم گردد.
- کلیه کارهای روی نمونه، از قبیل تهیه لام، کشت، آنتی بیوگرام و نظایر آن باید در اتاق «آلوده» انجام گیرد.
- قبل از ورود به اتاق «آلوده» باید پیش بند، ماسک و دستکش در دست داشته باشند.
- پس از انجام کار روی میز کار و داخل کابینت با محلول ۲/ ۵ درصد آمفیل یا محلول مناسب دیگر ضدعفونی گردد.
- قبل از ترک اتاق کار، چراغ اولتراویوله داخل کابینت روشن شود.
- قبل از ترک اتاق پیش بند، ماسک و دستکش را درآورده و در ظرف مخصوص خود قرار دهند.
- بلافاصله بعد از خروج از اتاق دست های خود را بشویند.
- دور ریختن نمونه های آلوده
آلودگی میکروبی یکی از مشکلات مهم در فرایند تولید محصولات دارویی، آرایشی و بهداشتی است. میکروبها میتوانند با تجزیه مواد موثره دارویی و یا افزودنیها موجب فساد و از بین رفتن تاثیرگذاری، پایداری و یا کیفیت ترکیب دارویی شوند. همچنین حضور عوامل میکروبی بیماری زا میتواند یک تهدید جدی برای سلامت مصرف کنندگان فراورده باشد بویژه اینکه بسیاری از داروها برای افراد بیمار و در معرض خطر طراحی میشوند و ورود پاتوژن هرچند اندک به بدن فرد در معرض خطر می تواند مشکلات بسیار جدی را ایجاد کند.
متداول ترین عامل آلودگی میکروبی فراوردههای دارویی باکتریها هستند. حضور باکتری گرم مثبت در فراورده دارویی عمدتا نشان دهنده دخالت انسانی در فرایند تولید بوده و حضور باکتری های گرم منفی نشان دهنده عدم کنترل فرآیند در محیط تولید بخصوص سیستم آب و مواد اولیه دارویی است. باکتری های گرم منفی میله ای متداول ترین عوامل شناسایی شده در فراورده های دارویی غیر استریل هستند.
برای شناسایی آلودگی میکروبی در فرآورده دارویی میتوان از تست های روتین مانند روش های کشت میکروبی و آزمون های میکروبی متداول برای شناسایی میکروارگانیسم ها استفاده کرد که این روش ها ممکن است به صورت سنتی و یا با استفاده از کیت های شناسایی مانند کیت API به کار گرفته میشوند.
کیت API برای شناسایی سریع عامل میکروبی شامل تعداد زیادی از تست های بیوشیمیایی شناسایی میکروارگانیسم ها که به صورت پک شده ارائه شده است.
علاوه بر این امروزه روش های جدیدی بر مبنای روش های مولکولی مانند PCR و توالی یابی نیز پایه گذاری شده است که در این سیستم با دقت بسیار بالا میکروارگانیسم آلوده کننده شناسایی میشود. مبنای این شناسایی توالی های حفاظت شده و اختصاصی میکروارگانیسم ها مانند RNA های ریبوزومی مانند 16S rRNA هستند.
کشت میکروبی فراورده دارویی
اولین مرحله از تشخیص آلودگی، اثبات آلودگی فراورده به میکروارگانیسم است و متداول ترین راه برای اثبات آلودگی کشت است. کشت میکروبی بایستی در محیط های استاندارد کشت باکتریایی و قارچی انجام شده و در فرایند کشت بایستی به خصوصیات مهارکنندگی رشد ترکیب دارویی بایستی توجه داشت، زیرا خاصیت باکتریواستاتیک بودن یک ترکیب دارویی نمیتواند دلیلی برای عدم آلودگی ترکیب به یک عامل پاتوژن باشد.
شناسایی میکروارگانیسم آلوده کننده به روش بیوشیمیایی
در اولین مرحله بایستی نوع میکروارگانیسم مشخص شود. اگر میکروارگانیسم مربوط به دسته باکتری ها بود بایستی از فلوچارت شناسایی باکتری ها استفاده شود. اولین قدم و متداول ترین روش شناسایی باکتریها رنگ آمیزی گرم است که در این روش دسته بندی اصلی باکتری مورد مطالعه و شکل ظاهری باکتری مورد ارزیابی قرار میگیرد.
بر اساس راهنمای شناسایی میکروبی برگی ” Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology ” مراحل بعدی تست های شناسایی قابل انجام هستند. به عنوان مثال در مورد باکتری های گرم مثبت کوکسی، رشد در محیط مانیتول سالت آگار (MSA) ، تست های کاتالاز، DNAse، همولیز خون، اوره آز و حساسیت به نووبیوسین از تست هایی هستند که در مورد این دسته از باکتری ها مورد استفاده قرار میگیرند.
برای باسیل های گرم مثبت تست هایی مانند هیدرولیز نشاسته و تست های کاتالاز و Voges Proskauer انجام میشود و ممکن است روش های رنگ آمیزی اسپور برای این دسته از باکتری ها مورد استفاده قرار گیرد.
گرم منفی ها را می توانیم بر اساس رشد روی محیط مک کانکی و ستریماید آگار مورد ارزیابی قرار داد و بر اساس رشد روی این محیط ها تست های بیوشیمیایی بعدی مشخص میشود. تست های بیوشیمیایی متداول برای گرم منفی ها تست های تولید ایندول، متیل رد، VP، مصرف سیترات، اوره آز، خصوصیت اکسیداتیو/فرمنتاتیو، تست حرکت و رشد روی محیط TSI هستند.
البته در اینجا هدف توضیح روش های شناسایی باکتری ها نیست و صرفا روش های شیمیایی مورد استفاده در شناسایی باکتری ها نام برده شدند. لازم به ذکر است که برخی از کیت های تجاری مانند تست API نیز برای شناسایی باکتری ها ارائه شده اند که گاهی جایگزین تست های افتراقی و گاهی مکمل این تست ها در مراحل شناسایی باکتری های آلوده کننده فرآورده های دارویی هستند.
شناسایی مولکولی میکروارگانیسمها
روش شناسایی مولکولی شامل کشت اولیه میکروارگانیسم و استخراج DNA است. پس از استخراج DNA میتوانید با تکثیر بخش 16s rRNA در باکتری ها و 26S و یا 18s در مخمرها و قارچ ها و تعیین توالی بخش تکثیر شده سویه جداسازی شده را به دقت شناسایی نمود. البته قبل از شناسایی مولکولی بایستی تست های اولیه بیوشیمیایی انجام شده و عمل استخراج و PCR در یک کلنی خالص انجام شود.
البته امکان طراحی پرایمر های اختصاصی برای سویه های مشخصی از باکتری ها نیز وجود دارد و در این حالت با انجام PCR سویه مورد نظر شناسایی خواهد شد. اگرچه این روش برای سویه های محدودی امکان پیاده سازی دارد اما با توجه به اینکه سویه های غالب آلوده کننده در فرآورده های دارویی تا حدودی مشخص هستند این روش می تواند سرعت شناسایی را تا حد قابل توجهی افزایش دهد.
داروهای استریل و غیراستریل
بدون شک تمامی فرآورده های دارویی و آرایشی و بهداشتی استریل نیستند. داروهای استریل داروهایی هستند که به هیچ عنوان نباید دارای بار میکروبی باشند و تست های میکروبی در این داروها با سختگیرانه ترین حالت انجام میشود. اما فراورده های غیر استریل، بایستی عاری از میکروارگانیسم های پاتوژن و بیماری زا باشند، اما وجود مقدار مشخصی از میکروارگانیسم های غیر پاتوژن برای این محصولات مشکلی ایجاد نخواهد کرد.
تست حد میکروبی یا microbial limit test (MLT) نشان دهنده میزان و نوع میکروارگانیسم زنده ای است که در یک دارو یا فراورده آرایشی و بهداشتی غیر استریل میتواند وجود داشته باشد. این تست میتواند برای مواد اولیه و یا محصول نهایی مورد ارزیابی انجام شود.
منابع
- https://food.r-biopharm.com/analytes/microbiology/
- با سپاس و قدردانی فراوان از مجموعه زیست ژن بافت
