انجام تست های تعیین هویت میکروارگانیسم ها و شمارش کلونی
انجام تست های تعیین هویت میکروارگانیسم ها و شمارش کلونی
تست IMViC
یکی از تست های بیوشیمیایی مهم جهت جداسازی و تعیین هویت میکروارگانیسم ها در مواد غذایی می باشد. در این مقاله یک بررسی جامع از تست IMViC و کاربردهای آن ارائه می دهیم.
تست IMViC مجموعه ای از چهار آزمایش است که جهت تعیین وجود باکتری های خاص در یک نمونه استفاده می شود. درواقع کلمه IMViC از کنار هم قرار دادن حروف اول این آزمایش ها ساخته شده است:
- I: مشخصه تست ایندول
- :Mمشخصه تست متیل رد
- :Vمشخصه تست وژس پرسکوئر
- :Cمشخصه تست سیترات
به طور کلی هر آزمایش ویژگی های متابولیکی متفاوتی از باکتری را ارزیابی می کند و به شناسایی آن کمک می کند. این یک تکنیک پرکاربرد در آزمایشگاه های میکروبیولوژیکی است.
تست ایندول
برای انجام این تست از محیط کشت های پپتون واتر یا تریپتـون بـراث و یا محیط کشت SIM استفاده می شود . در این محیط ها اسید آمینه تریپتوفان وجود دارد که مورد استفاده برخی از باکتریها قرار می گیرد . باکتریهای تولید کننده ایندول دارای آنزیم تریپتوفاناز هستند که قادر به شکستن و تجزیه تریپتوفان و تولید ایندول هستند. توجه شود که بهتر است محیط های غذایی فاقد گلوکز باشند زیرا گلوکز مانع تولید ایندول می شود . تست ایندول بعد از ۴۸ ساعت باید حتماً مورد بررسی قرار گیرد زیرا ایندول ممکن است بعدازاین مدت مورد حمله باکتری ها قرار گرفته و ناپدید شـود . جهـت تـشخیص توليـد ایندول در محیطهای کشت معمولاً از معرف کواکس برای میکروارگانیسم های هوازی و ارلیخ (ارلیش) برای میکروارگانیسم های بی هوازی استفاده می شود .مراحل انجام آزمایش شامل:
- تهیه محیط کشت مورد نظر داخل لوله آزمایش
- کشت باکتری مورد نظر
- اینکوباتور گذاری (37 درجه سانتی گراد و 48 ساعت)
- افزودن 2 تا 3 قطره معرف کواکس جهت تشخیص تولید ایندول
- تکان دادن لوله (به آرامی)
اگر ایندول وجود داشته باشد رنگ قرمز پررنگی دربالای لوله تشکیل می شود ( حلقه ارغوانی ) ممکن است ۱۰ تا ۱۵ دقیقه طول بکشد تا حلقه ارغوانی تشکیل شود در این مدت لوله را متناوبا تکان دهید.
اگر از محیط کشت SIM در این آزمایش استفاده شود دو پارامتر دیگر نیز در این آزمایش تشخیص داده می شود . در این محیط کشت اسیدهای آمینه گوگرددار ( سیستئین و متیونین ) وجود دارند که بعضی از باکتریها آنها را مصرف کرده و تولید گاز H2S می کننـد وایـن گاز با آهن موجود در محیط واکنش داده و رسوب سیاهرنگ FeS به وجود می آید . بنابراین با بررسی وجود و یا عدم وجود رسوب سیاهرنگ در این محیط کشت می توان تولید و يا عـدم توليـد گاز H2S را توسط باکتریها تشخیص داد .
تست متیل رد
هدف از انجام تست متیل رد تشخیص توانایی باکتری های مختلف در تولید اسید از گلوکز است. زیرا برخی از باکتری ها گلوکز را مصرف کرده و مقادیر زیادی اسید تولید می کنند که pH محیط را به زیر 4/4 کاهش می دهند. این موضوع را با استفاده از این تست میتوان بررسی کرد. زیرا معرف متیل رد در pH بالای 5/1 زرد و زیر 4/4 قرمز است. مراحل انجام آزمایش شامل:
- کشت باکتری در محیط کشت MRVP ( متیل ردوکس- پروسکوئر براث) یا محیط کشت گلوکز فسفات براث
- اینکوباتورگذاری (دمای 25 یا 37 درجه سانتی گراد و 24 تا 48 ساعت)
- افزودن 6 تا 8 قطره معرف متیل رد
در صورت ایجاد رنگ قرمز نتیجه تست مثبت است و بدان معنی است که باکتری گلوکز را مصرف و اسید زیادی تولید کرده است و در صورت ایجاد رنگ زرد نتیجه تست منفی است و باکتری گلوکز را مصرف و اسید کم تولید کرده است.
تست وژس پرسکوئر
این تست جهت تشخیص باکتری هایی که گلوکز را تخمیر میکنند و استوئین تولید می کنند، به کار می رود. همچنین این تست جهت تشخیص اشرشیا کلی از انتروباکتر و کلبسیلا بسیار موثر است. استوئین یک ماده حد واسط است و در محیط قلیایی به دی استیل تبدیل می شود و این دی استیل مسئول تولید رنگ در ازمایش می باشد. مراحل انجام آزمایش شامل:
- 1. کشت باکتری در محیط کشت MRVP ) متیل ردوکس- پروسکوئر براث) یا محیط کشت گلوکز فسفات براث
- 2. اینکوباتورگذاری (دمای 25 یا 37 درجه سانتی گراد و 24 تا 48 ساعت)
- 3. افزودن 12 قطره معرف باریت
- 4. قرار دادن لوله به حال خود به مدت 30 الی 45 دقیقه
در صورت مثبت بودن نتیجه تست، بعد از 45 دقیقه مورد نظر رنگ صورتی در سطح مشخص میشود و بعد از حدود 2 ساعت واکنش شدیدتر می شود و رنگ قرمز می شود.
تست سیترات
برای انجام این آزمایش از محیط کشت سیمون سیترات آگار استفاده می شود که یکی از محیطهای جامد لوله ای است . ترکیبات این محیط کشت عبارتند از : ( آمونیوم دی هیدروژن فسفات ، سدیم آمونیوم هیدروژن فسفات ، کلرور سدیم ، سیترات سدیم ، سولفات منيزيم ، بـرم تیمول بلو و آگار ) . معرف این محیط کشت برم تیمول بلو است که در محیط قلیایی آبی، در محیط اسیدی زرد و در محیط خنثی سبز رنگ است . هدف از این تست بررسی قدرت باکتریها در استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن و در نتیجه تغییر pH محیط است . بعضی از باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه آنزیم سیترات پرمئاز تولید می کنند که قادر به تجزیه سیترات هستند : CO2 حاصل از این واکنش با سدیم و آب ترکیب می شود و ایجاد کربنات سدیم می کند که محیط را به شدت قلیایی می کند و یا اینکه باکتریهای تجزیه کننده سیترات از نمکهای آمونیاکی به عنوان منبع نیتروژن استفاده کرده و تولید NH3 می کنند که محیط را قلیایی می کند . مراحل انجام آزمایش شامل:
- تهیه محیط کشت سیمون سیترات آگار در داخل لوله های آزمایش
- قرار دادن لوله های به صورت شیب دار و منعقد شدن
- کشت باکتری مورد نظر( قسمت عمقی محیط را به صورت ضربه ای و سطح شیب دار را به صورت زیگزاک مانند کشت دهید)
- اینکوباتورگذاری(24 تا 48 ساعت و با دمای 25 تا 37 درجه سانتی گراد)
اگر رنگ محیط آبی شود نتیجه تست سیترات مثبت است و سیترات تجزیه شده و محیط قلیایی شده است و در غیر این صورت سیترات منفی است.
تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای باکتریایی
ردیابی و شناسایی باکتریها توسط پنج روش رایج در نمونه های بالینی صورت می گیرد:
- میکروسکوپی
- ردیابی آنتی ژن باکتریایی
- ردیابی اسید نوکلئیک اختصاصی باکتری
- کشت
- ردیابی آنتی بادی اختصاصی باکتری (سرولوژی)
هرچند بیشتر ارگانیسم ها را می توان با تکنیک های متنوع به صورت اختصاصی شناسایی نمود، اما رایج ترین روش مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص طبی برای شناسایی و تعیین هویت یک ایزوله (متعاقب کشت) توسط تست های بیوشیمیایی صورت می گیرد؛ بنابراین با شناخت روشها و تست های بیوشیمیایی و با کمک از مورفولوژی میکروسکوپی و ماکروسکوپی می توان به وجود عامل بیماری پی برد و آن را شناسایی کرد. در این مقاله سعی بر آن شده است که تست های متنوع و پرکاربرد (بیشترباکتریهای گرم مثبت) در آزمایشگاه میکرو بشناسی مورد بررسی قرار گیرد.
مروری بر چند تست رایج:
تست کوآگولاز
در میکروبشناسی ازاین تست برای جداسازی استافیلوکوک اورئوس ازبقیه استافیلوکوکها استفاده می شود . در این تست از پلاسمای خرگوش یا انسان همراه با 1% EDTA یا سدیم سیترات 3- 2% استفاده می شود. در 5. 0سی سی پلاسمایی که به نسبت 1 به 5 با سرم فیزیولوژی رقیق شده است، چند کلنی را حل کرده و در 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود. بعد از 1 تا 4 ساعت از نظر ایجاد لخته بررسی نموده و در صورت منفی بودن 24 ساعت بعد نیز بررسی می شود.
تست کوآگولاز اسلایدی
روی یک لام یک یا دو کلونی در سرم فیزیولوژی حل می کنیم تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل شود. یک قطره پلاسما به سوسپانسیون افزوده و با کمک لوپ، سوسپانسیون یکنواختی ایجاد می کنیم. ایجاد توده لخته مانند در مدت 5 تا 10 ثانیه بیانگر مثبت بودن تست است و در صورتی که تست کوآگولاز اسلایدی منفی شود باید روش لوله ای را انجام داد.
تست کاتالاز
یکی از موارد استفاده از این تست برای جداسازی استافیلوکوک ها از استرپتوکوک ها می باشد.استافیلوکوکها کاتالاز مثبت، ولی استرپتوکوک ها کاتالاز منفی هستند.آب اکسیژنه یکی از محصولات نهایی متابولیسم اکسیداتیو باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری است که تجمع آن برای باکتری خطرناک است. آنزیم کاتالاز موجود در باکتری، این ماده خطرناک را به H2O و O2 تجزیه می کند.
یک یا دو قطره آب اکسیژنه 3% روی لام ریخته و چند کلونی داخل آن حل می کنیم. در صورتی که باکتری کاتالاز مثبت باشد به سرعت شروع به تولید O2 می کند که به صورت حباب هایی روی سطح لام مشاهده می شود. باید توجه داشت که استفاده از لوپ فلزی ممکن است مثبت کاذب دهد.
چنانچه از محیط بلادآگار استفاده شود، از ریختن آب اکسیژنه به طور مستقیم بر روی آن خودداری نموده و حتماً تست را روی لام انجام دهید زیرا گلبول های قرمز خود آنزیم کاتالاز دارند و تست به صورت مثبت کاذب، خوانده می شود. آب اکسیژنه موجود در بازار به صورت 30 % می باشد، بنابراین آب اکسیژنه 3% از فرمول C1V1=C2V2 بدست می آید.
تست DNase
اغلب سویه های استافیلوکوک اورئوس توسط تست کوآگولاز مشخص می شوند، ولی برخی از آنها واکنش کوآگولاز ضعیف دارند که می توان از تست DNase برای تشخیص آ نها استفاده کرد. تقریباً تمامی استافیلوکوک اورئوس ها DNase مثبت هستند. مراحل انجام آزمایش شامل:
باکتر یها را روی محیط DNase کشت داده و به مدت 24 – 18 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه کرده و پس از آن چند قطره HCL یک نرمال روی کلونی ها می ریزیم. اگر در اطراف کلونی ها ناحیه شفاف ظاهر شد دلیل بر مثبت بودن تست و اگر ناحیه تیره و مات ایجاد شود دلیل بر منفی بودن آن است.
تست هیدرولیز L) PYR پیروگلوتامیک اسید بتانفتیل آمید)
هدف انجام این تست تشخیص احتمالی استرپتوکوک گروه A و انتروکوک از سایر استرپتوکوک هاست.استرپتوکوک پیوژنز و گونه های جنس انتروکوک قادر به هیدرولیز PYR هستند این تست برای تشخیص استرپتوکوک پیوژنز اختصاصی تر از تست حساسیت به باسیتراسین بوده و برای انتروکوک به اندازه تست بای لاسکولین و کلریدسدیم اختصاصی می باشد. باکتری توسط پپتیدازهای خود PYR را هیدرولیز می کند و بتانفتیل آمید تولید می شود که با اضافه کردن معرف سیانامید رنگ قرمز تولید می گردد. مراحل انجام آزمایش شامل:
به دیسک کاغذی آغشته به PYR که قبلاً مرطوب شده مقداری از باکتری را تلقیح می کنیم و بعد از گذشت دو تا سه دقیقه مقداری از معرف سیانامید به آن اضافه می کنیم. تولید رنگ قرمز نشا ندهنده مثبت بودن تست است.
تست حلالیت در صفرا
حلالیت در صفرا یکی از خصوصیات باکتری پنوموکوک است که به موازات تست حساسیت به اپتوچین برای تشخیص این باکتری بکار می رود. این باکتری بعد از اینکه با صفرا مواجه می شود، اتولیزین های موجود در باکتری فعال شده و استرپتوکوکها را لیز می کنند.
از صفرای 10 % گاوی یا خرگوش که استریل شده است، استفاده می شود. سوسپانسیون غلیظی از باکتری موردنظر را به دزوکسیکولات سدیم اضافه کرده و پس از 3 ساعت انکوبه در 35 درجه سانتی گراد کدورت مایع موردنظر بررسی می شود.
تست اپتوچین
این تست در تشخیص استرپتوکوک پنومونیه استفاده می شود.محیط بلادآگار با کلونی موردنظر کشت داده می شود. یک دیسک اپتوچین (اتیل هیدروکوپروئین هیدروکلراید) در وسط پلیت قرار داده و پلیت را در جار شمع در دمای 35 الی 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه می کنیم. اگر رشد باکتری در اطراف دیسک مهار شود باکتری به اپتوچین حساس بوده و احتمالاً پنومونیه است.
شمارش کلونی
یکی از روش های کلاسیک برای تعیین غلظت میکروب ها در نمونه، رقیق کردن نمونه، رشد میکروب ها در پلیت ها و شمارش کلنی ها است. میکروب های کشت داده شده از یک واحد تشکیل دهنده کلنی متشکل از یک یا چند سلول به یک کلنی قابل مشاهده رشد می کنند که قابل مشاهده و شمارش است. باکتری ها رایج ترین میکروبی هستند که با استفاده از شمارش پلیت ها ارزیابی می شوند. شمارش کلونی برای شناسایی و شمارش میکروب ها در خاک، آب و غذا استفاده می شود. پروتکل های شمارش کلنی ها بر یک رویکرد دقیق و روشمند تأکید دارند.
رقیق کردن نمونه ها، کشت روی سطح پلیت و انکوباسیون
اگر به سادگی یک نمونه میکروبی را روی یک پلیت آگار کشت دهید، تعداد زیادی واحد تشکیل دهنده کلنی خواهید دید که کلنی های جداگانه با هم ترکیب می شوند و شمارش آنها غیرممکن می شود. برای حل این مشکل، نمونه را در یک محیط مایع مخلوط کرده، مقدار کمی از آن مخلوط را بردارید و آن را بیشتر رقیق کنید. این روند را شش تا 10 بار تکرار کنید. رقت نهایی را روی یک صفحه آگار پخش کنید و آن را به مدت چهار تا هفت روز قبل از شمارش کلنی ها انکوبه کنید.ترفند اصلی در شمارش کلنی ها این است که هر نقطه کلنی را یک بار بشمارید. یک روش این است که ظرف پتری را روی یک پسزمینه شبکه قرار دهید و کلنیها را در هر سلول شبکه شمارش کنید و در یک الگو در تمام سلولها حرکت کنید. علامت گذاری کلنی های شمارش شده در پشت ظرف پتری نیز می تواند یک رویکرد مفید باشد.
تست شمارش کلونی
تعداد کل زنده مانی (Total Viable Count) آزمایشی است که تعداد کل میکروارگانیسمهایی مانند باکتریها، مخمرها یا گونههای کپک را که در یک نمونه آب وجود دارند، تخمین میزند. TVC ممکن است به عنوان تعداد کلنی های هوازی نیز بیان شود. تکنیک کلنی کانت (Colony counting) برای کشت باکتری و قارچ از یک محیط مایع بر روی پلیت کشت در آزمایشگاه میکروبیولوژی استفاده می شود که هم روش به نسبت آسانی است و هم شمارش باکتری ها از این روش میسر می شود.
روش ها زیادی تا به امروز برای جداسازی میکروارگانیسم ها شرح داده شده است که برای جداسازی باکتری ها و قارچ های متفاوت از نمونه های بالینی و یا محیط های متفاوت استفاده می شود. روش پخش کردن در سطح پلیت یکی از رایج ترین روش های کشت باکتری در آزمایشگاه میکروبیولوژی می باشد. ترفند اصلی در شمارش کلنی ها این است که هر نقطه کلنی را یک بار بشمارید.
یک روش این است که ظرف پتری را روی یک پسزمینه شبکه قرار داده و کلنیها را در هر سلول شبکه شمارش کنید و در یک الگوی روشمند در تمام سلولها حرکت کنید. علامت گذاری کلنی های شمارش شده در پشت ظرف پتری نیز می تواند یک رویکرد مفید باشد.
منابع
- با سپاس و قدردانی فراوان از مجموعه زیست ژن بافت
