ترانسداکشن سلول با ویروس

ترانسداکشن سلول با ویروس

استفاده از وکتورهای ویروسی برای وارد کردن DNA اگزوژن به سلول ها از دهه 1970 صورت گرفته است (Goff & Berg, 1976). امروزه ناقل های ویروسی برای اهداف مختلفی استفاده می شوند مانند:

• تولید رده‌های سلولی که یک ژن خارجی برچسب‌دار یا بدون برچسب را بیان می‌کنند.
• معرفی یک جهش ژنی
• خاموش کردن یک ژن
• توسعه واکسن

ناقل‌های ویروسی قادر به انجام کارهای باورنکردنی هستند، اما وقتی به درستی کار نمی‌کنند، می‌تواند بسیار خسته کننده باشد.

قبل از شروع انتقال ویروس، زمانی را در نظر بگیرید که چه چیزی برای اطمینان از موفقیت آزمایش شما لازم است! به دلیل انواع مختلف سلول‌های هدف، ناقل‌های ویروسی، تقویت‌کننده‌ها و دیگر معرف‌های دخیل در انتقال ویروس، طیف گسترده‌ای از شرایط وجود دارد که شما باید برای دستیابی به حداکثر سطوح بیان بهینه‌سازی کنید. ما به شدت توصیه می کنیم از یک کنترل مثبت مانند abm استفاده کنیدLenti-GFP یاAAV-GFP، برای امتحان شرایط آزمایشی مختلف در یک صفحه چند چاهی برای تعیین شرایط بهینه برای آزمایش انتقال خاص شما.

نکاتی برای  ترانسداکشن موفق

به طور کلی، در اینجا چند نکته برای یک ترانسدوشن موفق وجود دارد:

1. ترکیب ویروسی خود را متمرکز و تیتر کنید : تیترهای ویروسی بالاتر معمولاً کارایی انتقال را افزایش می دهد! یکی از راه‌های متمرکز کردن ویروس این است که ذخایر ویروسی خود را با اولتراسانتریفیوژ پلت کنید و مجدداً در حجم کمتری معلق کنید.
2. چندگانگی عفونت (MOI) خود را بهینه کنید: تعیین کنید که چند ذره ویروسی برای عفونت 100% سلول های هدف شما مورد نیاز است. افزودن بیش از حد ذرات ویروسی در هر سلول منجر به سمیت سلولی می شود در حالی که اضافه کردن تعداد بسیار کمی منجر به راندمان انتقال پایین می شود.
3. بررسی کنید که ویروس شما با موفقیت بسته بندی شده است: اگر ساختار ویروسی شما حاوی نشانگر انتخاب آنتی بیوتیک یا گزارشگر فلورسنت باشد، سلول های بسته بندی شما تحت آنتی بیوتیک قابل انتخاب هستند یا در زیر میکروسکوپ فلورسنت فلورسنت به نظر می رسند.
4. از چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید: هنگام ذخیره یا نگهداری ذخایر ویروسی خود، از انجماد و ذوب بیش از حد با تقسیم به ذخایر کوچکتر یا برنامه ریزی آزمایش خود اجتناب کنید تا بتوانید فوراً از لنتی ویروس های تازه برداشت شده خود برای عفونت استفاده کنید.
5. افزایش تماس ویروس با سلول: می توانید از تقویت کننده های انتقال (به عنوان مثال پلی برن یا abm’s ViralEntry™ تقویت کننده انتقال) برای بهبود عفونت ویروسی استفاده کنید. این معرف ها دافعه الکترواستاتیکی بین سلول با بار منفی و غشای ویروسی را کاهش می دهند.

محدودیت اندازه درج ژن

مانع دیگر اندازه ژنی است که می توان آن را در ناقل قرار داد. دو استراتژی وجود دارد که می توانید امتحان کنید:

1. روش بردار همپوشانی: از دو نیمه همپوشانی از یک ژن رمزگذاری شده در دو ناقل rAAV جداگانه استفاده کنید و همزمان آنها را به سلول‌های هدف تبدیل کنید، جایی که نوترکیبی همولوگ از طریق توالی‌های همپوشانی اتفاق می‌افتد.
2. روش ترانس اسپلایسینگ : بسته بندی دو نیمه غیر همپوشانی از یک تراریخته به دنبال ترکیب بین مولکولی با واسطه ITR و پیرایش بعدی. این یک روش موثرتر است که می تواند منجر به افزایش 3 تا 12 برابری موفقیت در تولید یک محصول تراریخته با طول کامل، در مقایسه با روش بردار همپوشانی که قبلا ذکر شد، شود. (دوان و همکاران، 2001)

منابع

• Buchschacher, G. L., Jr, & Wong-Staal, F. (2000). Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases. Blood, 95(8), 2499–2504.

• Chen, S., Wasserfall, C., Kapturczak, M. H., Atkinson, M., & Agarwal, A. (2006). Freeze-thaw increases adeno-associated virus transduction of cells. American journal of physiology. Cell physiology, 291(2), C386–C392. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00582.2005

• Davis, H. E., Morgan, J. R., & Yarmush, M. L. (2002). Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophysical chemistry, 97(2-3), 159–172. https://doi.org/10.1016/s0301-4622(02)00057-1

• Duan, D., Yue, Y., & Engelhardt, J. F. (2001). Expanding AAV packaging capacity with trans-splicing or overlapping vectors: a quantitative comparison. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 4(4), 383–391. https://doi.org/10.1006/mthe.2001.0456

• Gene expression vectors and viruses. (n.d.). Applied biological materials inc. https://www.abmgood.com/Vectors.html

• Goff, S. P., & Berg, P. (1976). Construction of hybrid viruses containing SV40 and lambda phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells. Cell, 9(4 PT 2), 695–705. https://doi.org/10.1016/0092-8674(76)90133-1

• Haery, L. 5 Tips for Troubleshooting Viral Transductions. Addgene blog. August 11, 2016, https://blog.addgene.org/5-tips-for-troubleshooting-viral-transductions

• Hammond, S. L., Leek, A. N., Richman, E. H., & Tjalkens, R. B. (2017). Cellular selectivity of AAV serotypes for gene delivery in neurons and astrocytes by neonatal intracerebroventricular injection. PloS one, 12(12), e0188830. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188830

• Jang, M., Lee, S. E., & Cho, I. H. (2018). Adeno-Associated Viral Vector Serotype DJ-Mediated Overexpression of N171-82Q-Mutant Huntingtin in the Striatum of Juvenile Mice Is a New Model for Huntington’s Disease. Frontiers in cellular neuroscience, 12, 157. https://doi.org/10.3389/fncel.2018.00157

• با سپاس و قدردانی فراوان از مجموعه زیست ژن بافت​