تست های بلاتینگ

بلاتینگ

به‌طور کلی در ژنتیک مولکولی به عمل انتقال مولکولهای تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک غشاء ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود.  معنای واژه انگلیسی بلاتینگ، لکه‌گذاری است.

برای انجام اعمالی مانند هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک و شناسایی پروتئینها با پادتن‌ها، ژل محیط مناسبی نیست. علت اصلی این مسئله نفوذپذیری کم ژل و خروج شناساگرها (Probe)  از ژل می‌باشد. از این رو در صورت انجام عمل آشکارسازی به کندی و با مشکل صورت می‌گیرد. اما غشاء، محیط مناسبی برای اعمال فوق فراهم می‌کند.

به چهار دسته زیر تقسیم میشود :

• سادرن بلاتینگ
• وسترن بلاتینگ
• نوردن بلاتینگ
• ایسترن بلاتینگ

سادرن بلاتینگ

برای انتقال مولکولهای DNA از ژل به غشاء از روشی استفاده می‌شود که سادرن بلاتینگ نام دارد (در فارسی اشتباهاً ساترن بلاتینگ هم نوشته شده). این روش ابتدا توسط ادوین سادرن از دانشگاه آکسفورد ابداع شد. در این روش از خاصیت موئینگی، برای انتقال مولکولهای DNA  استفاده می‌شود. اصول این روش به این صورت است که پس از تفکیک مولکولها بر روی ژل، آن را در محلول هیدروکسید سدیم قرار داده تا مولکولهای DNA  دو رشته‌ای واسرشت شوند.

درصورتیکه که ژل حاوی مواد واسرشت کننده باشد نیازی به این مرحله نیست. سپس ژل بر روی سکویی که دریک ظرف حاوی بافر قرار دارد، منتقل نموده و بر روی آن غشاء نیتروسلولز قرار می‌دهند. بر روی غشاء مزبور چندین لایه کاغذ نمگیر قرار داده می‌شود. این لایه‌ها باعث برقراری جریان بافر به سمت بالا، از ژل به غشا می‌شوند. همراه با جریان بافر، مولکولهای DNA از ژل خارج شده و بر روی غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی قرار می‌گیرند.

غشاء هائی که برای این منظور به کار گرفته می‌شوند، کاملاً اختصاصی بوده ودارای بار الکتریکی مثبت می‌باشند، در نتیجه مولکولهای اسید نوکلئیک به‌طور محکم به آن‌ها متصل می‌شوند.

• از سادرن بلاتینگ برای شناسایی جایگاه یک ژن در کل ژنوم و تعین تعداد مولکول ترانس‌ژن نیز استفاده می‌شود.

وسترن بلاتینگ

برای انتقال پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل به غشاء از تکنیک وسترن بلاتینگ استفاده می‌شود. این روش نیز مشابه روش سادرن بلاتینگ می‌باشد ، با این تفاوت که جریان بافر به صورت افقی است. اخیرا روشهای بلاتینگ جدیدی از ترکیب روشها ابداع شده‌اند. از جمله این روشها روش بلاتینگ جنوب غربی و بلاتینگ شمال غربی را می‌توان نام برد. روش اول برای انتقال پروتئینهایی که به DNA متصل می‌شوند استفاده می‌شود و روش دوم برای پروتئینهایی که به RNA   متصل می‌شوند، به کار گرفته می‌شود.
.

نوردن بلاتینگ

به انگلیسی: (Northern blot)  تکنیکی است که در تحقیقات بیولوژی مولکولی به منظور مطالعه بیان ژن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این بررسی بر پایه تشخیص RNA  یا Mrna استخراج شده از یک نمونه ، صورت میگیرد.

با استفاده از این تکنیک می‌توان با تعیین میزان بیان یک ژن خاص در شرایط مختلف (مثلاً در شرایط بیماری)، ساختار یا اعمال کنترل سلول را مورد بررسی قرار داد. نوردرن بلات شامل بکار بردن الکتروفورز به منظور جداسازی نمونه‌های  RNA  بر اساس اندازه و تشخیص RNA ی مورد نظر با استفاده از اتصال یک پروب نشاندار به آن است.
عبارت بلات شمالی (northern blot)  به ‌طور خاص به انتقال موئین RNA  از ژل الکتروفورز به غشای بلات  (blotting membrane) اشاره دارد.

این روش در سال ۱۹۷۷ توسط جیمر آلوین، دیوید کمپ و جورج استارک در دانشگاه استنفورد توسعه یافت.علت نامگذاری نوردرن بلات، شباهت این تکنیک به اولین تکنیک بلاتینگ بنام ساترن بلات بود. Southern blot  توسط زیست‌شناسی بنام ادوارد ساترن به این نام خوانده شد. تفاوت اصلی این دو روش بلاتینگ در این است که در نوردرن بلات، بجای DNA، RNA  مورد بررسی قرار می‌گیرد.

از آنجا که RNA  به سختی به کاغذهای نیتروسلولزی متصل می‌شود، از روش سادرن نمی‌توان برای مولکولهای RNA  استفاده کرد. برای انتقال مولکولهای RNA  از روشی بنام نوردرن بلاتینگ استفاده می‌شود.

اساس این روش مشابه روش سادرن بلاتینگ است. با این تفاوت که در آن از کاغذهای فعال شده یا کاغذهای DBM، استفاده می‌شود. این کاغذها را می‌توان به راحتی با تیمارهای شیمیایی خاصی از کاغذ صافی تهیه کرد. در این روش، به علت تک رشته‌ای بودن RNA و تفکیک آن بر روی ژل واسرشت کننده نیازی به مرحله مجاورت با هیدرکسید سدیم نمی‌باشد. در ضمن به علت حساس بودن مولکولهای RNA دقت بیشتری در انجام مراحل لازم می‌باشد.

• microRNAs  ها که از سلول‌های مختلف میزبان و ویروس‌ها منشأ می‌گیرند، نقش مهمی در سیکل عفونت ایفا می‌کنند. شناسایی microRNAs و اینکه چه اثری بر میزبان خود دارند اساساً با روش نورترن ‌بلاتینگ انجام می‌شود .همانطور که گفته شد روش نورترن ‌بلاتینگ سبب جداسازی microRNAs از نظر سایز می‌شود و می‌تواند اطلاعات جامعی از سایز و ساختمان اصلی آن بدهد، بنابراین می‌تواند یک وسیله باارزش برای کشف و شناسایی انواع جدید microRNAs  باشد.

مزایای تکنیک بلاتینگ

1.استفاده در مطالعات بیان ژن، برای مشاهده بیان بیش از حد ژن‌های ایجادکننده سرطان و بیان ژن
2.برای تشخیص چندین بیماری، به عنوان مثال «بیماری کرون» (Crohn’s disease)
3.برای تشخیص micRNA‌های ویروسی که نقش مهمی در عفونت ویروسی دارند.
4.برای غربالگری نوترکیب‌ها با شناسایی mRNA تشکیل شده توسط ترانس ژن‌ها.

• BlotBaseیک پایگاه داده آنلاین است که نتایج انواع تست های  بلات را منتشر می‌کند. این پایگاه بیش از ۷۰۰ نسخه نوردرن بلات از نمونه‌های انسان و موش، در بیش از ۶۵۰ ژن و ۲۵ نوع مختلف بافت در خود جای داده‌است.

منابع

• Ghildiyal,M. and Zamore,P.D. (2009) Small silencing RNAs: anVarallyay,E., Burgyan,J. and Havelda,Z. (2008) MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat. Protoc., 3, 190–196.

• Engler-Blum, G.; Meier, M.; Frank, J.; Muller, G. A. (1993). “Reduction of Background Problems in Nonradioactive Northern and Southern Blot Analysis Enables Higher Sensitivity Than 32P-Based Hybridizations”. Anal. Biochem 210 (2): 235–.

• 20- Baldwin, D., Crane, V., Rice, D. (1999) A comparison of gel-based, nylon filter and microarray techniques to detect differential RNA expression in plants. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.

• 21-Utans, U.; Liang, P.; Wyner, L. R.; Karnovsky, M. J.; Russel, M. E. (1994). “Chronic cardiac rejection: Identification of five upregulated genes in transplanted hearts by differential mRNA display”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (14): 6463–6467. doi:1073/pnas.91.14.6463. PMC۴۴۲۲۲. PMID ۸۰۲۲۸۰۶.

• با سپاس و قدردانی فراوان از مجموعه زیست ژن بافت