تعیین غلطت پروتئینها
مروری بر روشهای سنجش پروتئین
کمی سازی غلظت پروتئین بخشی جدایی ناپذیر از هر جریان کاری آزمایشگاهی است که شامل استخراج، خالص سازی، برچسب زدن یا آنالیز پروتئین میشود. تعیین کمیت پروتئین اغلب قبل از پردازش نمونههای پروتئین برای جداسازی، جداسازی و تجزیه و تحلیل با روشهای کروماتوگرافی، الکتروفورتیک و ایمونوشیمیایی ضروری است. بسته به دقت مورد نیاز و میزان و خلوص پروتئین موجود، روشهای مختلفی برای تعیین غلظت پروتئین مناسب است.
ساده ترین و مستقیم ترین روش سنجش برای تعیین غلظت پروتئین در محلول، اندازه گیری جذب در 280 نانومتر (محدوده UV) است. اسیدهای آمینه حاوی زنجیرههای جانبی آروماتیک (به عنوان مثال، تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین) جذب نور UV قوی را نشان میدهند. پروتئینها و پپتیدها نور UV را متناسب با محتوای اسید آمینه معطر و غلظت کل جذب میکنند. روش دیگری که به طور سنتی در آنالیز اسید آمینه توسط HPLC استفاده میشود، برچسبگذاری تمام آمینهای اولیه (یعنی N-پایانه و زنجیره جانبی باقیماندههای لیزین) با رنگهای رنگی یا فلورسنت مانند نینهیدرین یا o-phthalaldehyde (OPA) است. روشهای جذب مستقیم نور UV و معرف HPLC دارای معایب خاصی هستند که این روشها را برای استفاده با نمونههای پروتئین معمولی در جریانهای کاری پروتئومیکس غیرعملی میسازد. روش جذب اشعه ماوراء بنفش برای مخلوطهای پروتئینی ایدهآل نیست زیرا پروتئینهای مختلف دارای محتوای اسید آمینه معطر متفاوتی هستند که ویژگیهای جذب را متفاوت میکند. علاوه بر این، هر محتوای غیر پروتئینی که نور ماوراء بنفش را جذب میکند، در اندازهگیریها اختلال ایجاد میکند.
برای غلبه بر این معایب، چندین روش رنگ سنجی و فلورسنت، روش سنجش پروتئین مبتنی بر معرف توسعه یافته است که تقریبا توسط هر آزمایشگاهی که در تحقیقات پروتئینی دخیل است استفاده میشود. نمونههای پروتئینی به معرف اضافه میشوند و به نسبت مقدار اضافه شده، تغییر رنگ یا افزایش فلورسانس ایجاد میکنند. غلظت پروتئین با ارجاع به منحنی استاندارد متشکل از غلظتهای شناخته شده یک پروتئین مرجع خالص تعیین میشود.
انواع روشهای سنجش پروتئین
- جذب UV
مزایا: ساده است، به هیچ معرف سنجشی نیاز ندارد.
معایب: مستعد خطا با مخلوطهای پروتئینی یا نمونههای پیچیده (مانند لیزات سلولی)
- روشهای بیوره: کیلاسیون پروتئین – مس و تشخیص ثانویه مس کاهش یافته
مزایا: سازگاری با اکثر سورفکتانتها (شویندهها)، تنوع پروتئین – پروتئین کمتری نسبت به سنجشهای مبتنی بر رنگ کوماسی
معایب: ناسازگاری با مواد کاهش دهنده مس – ناسازگاری با عوامل کاهنده رایج مانند DTT
- روشهای رنگ سنجی مبتنی بر رنگ: اتصال پروتئین به رنگ و تشخیص مستقیم تغییر رنگ
مزایا: اجرای سریع و آسان، در دمای اتاق انجام میشود، سازگار با اکثر نمکها، حلالها، بافرها، تیولها، مواد کاهنده و عوامل کلات کننده فلزی
معایب: ناسازگاری با سورفکتانتها (شویندهها)، تنوع پروتئین – پروتئین بالا در مقایسه با سنجشهای مبتنی بر مس
- روشهای رنگ فلورسنت: اتصال پروتئین به رنگ و تشخیص مستقیم افزایش فلورسانس مرتبط با رنگ متصل
مزایا: حساسیت عالی، نیاز به نمونه پروتئین کمتری برای اندازه گیری
معایب: به تجهیزات تخصصی نیاز دارد
انتخاب روش سنجش پروتئین
هیچ یک از معرفها را نمیتوان بهترین یا ایدهآلترین روش سنجش پروتئین در نظر گرفت. هر روشی مزایا و معایب خود را دارد. انتخاب از میان سنجشهای پروتئینی موجود معمولا بر اساس سازگاری روش سنجش پروتئین با نمونهها است. علاوه بر این، باید مواد تداخلی بالقوه موجود در نمونهها را در نظر گرفت که ممکن است بر روشهای سنجش خاص و همچنین دقت، تکرارپذیری و زمان انکوباسیون مورد نظر تأثیر بگذارد. بنابراین، روشی خوب است که با نمونههای مورد تجزیه و تحلیل سازگارتر است.
هدف این است که روشی را انتخاب کنیم که به کمترین دستکاری یا پیش تیمار نمونهها نیاز داشته باشد تا موادی را که در آزمون تداخل دارند، در خود جای دهد. از آنجایی که هیچ یک از معرفها را نمیتوان برای هر شرایطی ایدهآل یا بهترین روش سنجش پروتئین در نظر گرفت، اکثر محققان بیش از یک نوع سنجش پروتئین را در آزمایشگاههای خود انجام میدهند.
معیارهای مهم برای انتخاب روش عبارتند از:
- سازگاری با نوع نمونه و اجزای سازنده
- محدوده سنجش و حجم نمونه مورد نیاز
- یکنواختی پروتئین – پروتئین
- سرعت و راحتی برای تعداد نمونههای مورد آزمایش
- در دسترس بودن اسپکتروفتومتر یا صفحه خوان لازم برای اندازهگیری رنگ تولید شده (جذب) توسط سنجش
انتخاب استاندارد پروتئین
از آنجایی که پروتئینها در ترکیب اسید آمینه خود متفاوت هستند، هر یک در هر نوع سنجش پروتئین تا حدودی متفاوت پاسخ میدهند. بنابراین، بهترین انتخاب برای استاندارد مرجع، غلظت خالص و شناخته شده از فراوانترین پروتئین در نمونهها است.
برای بیشترین دقت در تخمین غلظت کل پروتئین در نمونههای ناشناخته، ضروری است که هر بار که سنجش انجام میشود، یک منحنی استاندارد لحاظ شود. این به ویژه برای روشهای سنجش پروتئین که منحنیهای استاندارد غیر خطی تولید میکنند، صادق است.
منابع
- Bradford, MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254.
- Smith, P.K, Krohn R.I., Hermanson G.T., et al. (1987) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85.
- Krohn, R.I. (2002). The Colorimetric Detection and Quantitation of Total Protein, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
- Krohn, R.I. (2001). The Colorimetric Determination of Total Protein, Current Protocols in Food Analytical Chemistry , B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
- Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Protein measurement with folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193, 265-75.
